雙氟胞苷對兔晶狀體上皮細胞體外生長(cháng)的抑制作用
作者：于海濤 王亞玲 楊青 閻洪祿
【摘要】 目的探討雙氟胞苷對培養的兔晶狀體上皮細胞(RLECs)體外生長(cháng)的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內障提供理論依據。方法在第3代體外培養RLECs中加入不同濃度雙氟胞苷，采用MTT比色法及血細胞板計數法觀(guān)察不同濃度的雙氟胞苷對體外培養的RLECs增殖的抑制作用。結果濃度為64 mg/L雙氟胞苷在24 h對RLECs無(wú)明顯的抑制作用;濃度為128~4 096 mg/L的雙氟胞苷在24、48、72 h對RLECs有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較差異有統計學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時(shí)間隨雙氟胞苷濃度的增高，對RLECs的抑制作用逐漸增強，各濃度之間比較差異具有統計學(xué)意義(q=2.122~10.524，P<0.05)。各實(shí)驗濃度的雙氟胞苷對RLECs的抑制作用隨作用時(shí)間延長(cháng)逐漸增強，在72 h抑制作用最強。MTT比色法結果與血細胞板計數法結果一致。結論雙氟胞苷可抑制體外培養RLECs的增殖，可用于抑制、預防后發(fā)性白內障的形成。
【關(guān)鍵詞】 雙氟胞苷;晶體;上皮細胞;細胞培養技術(shù);兔
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the depressant effect of Gemcitabine on the cells of rabbit epithelium lentis (REL) in vitro, and provide a theoretical evidence for treatment of aftercataract.MethodsThe cells of REL were cultured in vitro, and different concentrations of Gemcitabine were added into the cells of the third generation. The effect of Gemcitabine at different concentrations on the cells was measured with MTT staining colorimetry and cell count technique.ResultsThe Gemcitabine at the concentration of 64 mg/L for 24 h did not show inhibition on cells of REL (P>0.05); at 128-4 096 mg/L for 24 h, 48 h, and72 h showed obvious inhibition (F=22.248-34.090,q=2.188-11.353,P<0.05), the differences were significant as compared with the control. Under the same-time condition, the inhibitory action increased with the increase of the concentration of Gemci-tabine, the differences among different concentrations were significant (q=2.122-10.524,P<0.05). With the same concentration, the effect of prohibition depended on time. The result of MTT was consistent to that of cell count technique.ConclusionGemcitabine depresses the growth of REL cells cultured in vitro, which can be used to inhibit and prevent secondary cataract.
[KEY WORDS]gemcitabine; lens, crystalline; epithelial cell; cell culture technique; rabbits
后發(fā)性白內障是白內障囊外摘除術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥,也是影響病人術(shù)后視力的最主要原因之一，其術(shù)后1、3、5年的白內障發(fā)生率在成人可以高達11.8%、20.7%、28.5%[1-2]。有關(guān)實(shí)驗的結果表明，術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞的增殖和遷移，轉化為成纖維細胞，可能是形成后發(fā)性白內障的主要原因之一[3-4]。本實(shí)驗旨在觀(guān)察雙氟胞苷對培養的兔晶狀體上皮細胞(RLECs)體外生長(cháng)的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內障提供理論依據。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗動(dòng)物取實(shí)驗用家兔10只，體質(zhì)量為1.5～2.5 kg，雌雄不限，由青島大學(xué)醫學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗中心提供。
1.1.2主要試劑與藥品DMEM干粉培養基(GIBCO BRL 公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(GIBCO BRL 公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma 公司)，雙氟胞苷(美國禮萊亞洲公司)，青霉素鈉(華北制藥有限公司)，硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1培養液的配制將DMEM干粉培養基加入1 000 mL三蒸水配制成DMEM培養液，加入滅活的小牛血清,使之成為含體積分數0.150小牛血清的培養液，4 ℃冰箱保存。MTT溶液: 將MTT474用PBS液溶解，濃度為5 mg/L,兩層微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存。
1.2.2RLECs的培養實(shí)驗用兔空氣栓塞致死后，完整摘除眼球，在超凈工作臺內取出晶狀體，分離出連著(zhù)晶狀體赤道部的前囊膜。將晶狀體前囊膜剪成組織碎片，均勻鋪貼于培養瓶底壁，加入培養液置于培養箱中，至細胞游出相互融合，然后進(jìn)行傳代培養。取培養的第3代RLECs，制成細胞懸液，用血細胞板觀(guān)察四角大方格的細胞數[5-7]。
1.2.3實(shí)驗分組根據條件培養液的不同，隨機分為8組，陰性對照組(無(wú)血清培養液)和濃度為64、128、256、512、1 024、2 048、4 096 mg/L的雙氟胞苷無(wú)血清培養液組。
1.2.4RLECs計數①血細胞板計數法[8]：將RLECs懸液調整到細胞密度為2.5×107/L，平行接種到24孔培養板上，每孔1 mL，平行3個(gè)，放入CO2培養箱中10 h后取出，棄上清液，8組分別加入條件培養液，置CO2培養箱中培養24、48、72 h，觀(guān)察細胞形態(tài)學(xué)改變。分別于培養24、48、72 h后棄去條件培養液，加胰酶消化后，每孔加D-Hanks液1 mL，將細胞吹打均勻，用血細胞板計數，每孔計數8次，取平均值。②MTT比色法[9-11]：將RLECs懸液調整到細胞密度為5×107/L。平行接種于96孔培養板，平行3個(gè)，每板分為9組，每組6孔，第1組為200 μL不含細胞的空白對照組，其余8組分別加入200 μL上述密度的細胞培養液(含體積分數0.150小牛血清)，每孔細胞數約為5×103個(gè)，置CO2培養箱中培養。10 h后，分別將含有細胞的8組培養液棄去，按實(shí)驗分組加入條件培養液，置CO2培養箱中繼續培養。分別于24、48、72 h后棄去上清液，每孔再加20 μL濃度為5 g/L的MTT液，3 h后終止培養，棄去培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，在震蕩器上震蕩30 min，使結晶物充分溶解，在全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm波長(cháng)處的吸光度(A)值。結果以MTT比色法測定值減去空白對照組測定值表示。
1.2.5統計學(xué)處理實(shí)驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[12]軟件處理，組間比較采用方差分析。
2結果
2.1正常培養的RLECs形態(tài)學(xué)觀(guān)察
組織碎片在接種24~48 h后可見(jiàn)細胞游走出植片邊緣，貼壁生長(cháng)，細胞逐漸增多，隨時(shí)間延長(cháng)細胞密度增大，最初在靠近植片處，細胞呈團狀，3~4 d后大部分植片上的細胞游走出植片，圍繞植片生長(cháng)。6~7 d細胞生長(cháng)活躍，10 d左右形成圍繞植片的單層上皮細胞，鋪滿(mǎn)瓶底，達到融合狀態(tài)。原代培養的晶狀體上皮細胞呈透明狀，多角形或六邊形，保持上皮細胞的特征。傳代細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，單個(gè)細胞為圓形，6 h左右開(kāi)始貼壁生長(cháng)，24 h后約80%細胞貼壁，細胞增殖迅速，3~4 d達到融合。2~4代的晶狀體上皮細胞貼壁迅速，增殖快，生長(cháng)良好，呈展開(kāi)透明狀，排列不規則，與原代細胞無(wú)明顯差別，傳至6代后，細胞貼壁時(shí)間延長(cháng)，晶狀體上皮細胞變?yōu)槌衫w維細胞形狀，呈長(cháng)梭形、長(cháng)條狀，細胞大量增殖，中間出現拉網(wǎng)現象。
2.2雙氟胞苷對RLECs增殖的影響
2.2.1雙氟胞苷對RLECs形態(tài)學(xué)的影響 與陰性對照組比較，濃度為64 mg/L的雙氟胞苷作用于RLECs 24 h后，細胞形態(tài)無(wú)明顯差異;濃度為128～4 096 mg/L時(shí)，各實(shí)驗組的細胞數量逐漸減少，視野中所見(jiàn)細胞稀疏，細胞體積略小，細胞基質(zhì)較對照組亦減少。隨時(shí)間的延長(cháng)，上述現象更加明顯，實(shí)驗組在藥物作用48 h后，細胞數量進(jìn)一步減少，細胞收縮呈圓形，細胞基質(zhì)減少;在藥物作用72 h后，各實(shí)驗組的細胞數量及細胞基質(zhì)較24、48 h均明顯減少，在4 096 mg/L組中，視野中偶見(jiàn)小圓形細胞及稀疏的細胞基質(zhì)。
2.2.2血細胞板計數結果在24 h 時(shí)64 mg/L雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對照組比較無(wú)顯著(zhù)意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h時(shí)，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h時(shí)對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較，差異有統計學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時(shí)間內隨雙氟胞苷濃度的增高，對晶狀體上皮細胞的抑制作用逐漸增強，各濃度之間比較差異有顯著(zhù)性(q=2.122~10.524，P<0.05)。各濃度雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞抑制作用，隨時(shí)間的延長(cháng)而逐漸增強，從雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用血細胞板計數結果曲線(xiàn)來(lái)看，在72 h抑制作用最強。見(jiàn)圖1。
2.2.3MTT比色法結果在24 h 時(shí)64 mg/L雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對照組比較無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作 用，與陰性對照組比較，差異具有統計學(xué)意義(F=42.435~290.688，q=3.133~37.001，P<0.05)。
3討論
近年來(lái)，針對后發(fā)性白內障的發(fā)生機制，許多學(xué)者采用多種方法從不同的方向進(jìn)行研究，尤其是針對抑制殘留晶狀體上皮細胞增殖的藥物研究成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。白內障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞在晶狀體囊膜上的增生、移行、產(chǎn)生膠原，是白內障摘除人工晶狀體植入眼發(fā)生后發(fā)性白內障的主要原因，晶狀體上皮細胞增生移行至后囊可導致后囊混濁的形成[13-14]。
雙氟胞苷又稱(chēng)吉西他濱(2，2-二氟脫氧雙氟胞嘧啶核苷)，是一種新的胞嘧啶核苷衍生物，主要代謝產(chǎn)物在細胞內參入DNA，主要作用于G1/S期。雙氟胞苷能抑制核苷酸還原酶，導致細胞內脫氧核苷三磷酸酯減少，尚能抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶減少細胞內代謝物的降解，具有自我增效的作用，其對多種腫瘤有效。
本實(shí)驗主要采用雙氟胞苷局部用藥的方式，可以減少或消除全身用藥的副作用，另外可以提高藥物局部的濃度，更好地發(fā)揮雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的作用，為今后進(jìn)一步體內應用雙氟胞苷打下了理論基礎。
本實(shí)驗采用血細胞板計數法及MTT定量法觀(guān)察了雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞增殖影響，兩種方法所得實(shí)驗結果基本相同，都顯示了雙氟胞苷在低濃度(64 mg/L)對晶狀體上皮細胞無(wú)明顯抑制作用，與陰性對照組比較無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)，隨著(zhù)雙氟胞苷濃度的增高其抑制晶狀體上皮細胞增殖的作用逐漸增強，在24、48、72 h對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較，差異有顯著(zhù)性(P<0.05)，說(shuō)明雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用呈劑量依賴(lài)性。從MTT比色法A值曲線(xiàn)可以看出，同一濃度雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用在72 h作用最強，呈時(shí)間依賴(lài)性。
綜上所述，雙氟胞苷可抑制體外培養RLECs的增殖，并可因此抑制、預防后發(fā)性白內障的形成。因人晶狀體上皮細胞與RLECs的不同，且體外培養與活體的生理條件有諸多不同，需進(jìn)一步研究其在人體的作用。雙氟胞苷有望成為預防后發(fā)性白內障的藥物之一。
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