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人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序
H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種。2013年3月底，在上海和安徽兩地率先發(fā)現發(fā)現3人感染H7N9禽流感病例。H7N9型禽流感是全球首次發(fā)現的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報告傳染病監測報告系統，并且也尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現發(fā)熱等癥狀。下面是yjbys小編為大家帶來(lái)的人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準及操作程序的知識，歡迎閱讀。
一、目的
確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過(guò)程標準化、規范化，降低人為不規范操作對檢測結果造成的影響，保證結果的準確性和可重復性。
二、適用范圍
醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室按照《關(guān)于醫院開(kāi)展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知》(衛辦醫政函〔2013〕383號)和《關(guān)于做好醫療機構人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》(衛發(fā)明電〔2013〕29號)有關(guān)要求，使用國家疾病預防控制中心制備或商品化試劑盒開(kāi)展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。
三、樣本采集、運送和保存
1、盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)�？蓪⒈�、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率�；颊哂邢潞粑罉颖緯r(shí)，應優(yōu)先采集。
2、根據試劑說(shuō)明書(shū)對樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采集標準操作程序(SOP)，并組織樣本采集人員進(jìn)行培訓及考核。樣本的采集應當嚴格按照SOP進(jìn)行。
3、樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關(guān)規定進(jìn)行包裝，用密封容器立即送往實(shí)驗室。若氣溫高時(shí)，需放入冰塊降溫。樣本抵達實(shí)驗室后，應盡快進(jìn)行檢測，24小時(shí)內能檢測的樣本可置于2～8℃暫時(shí)保存，24小時(shí)內無(wú)法檢測的樣本則應置于≤-70℃狀態(tài)保存。如無(wú)-70℃保存條件時(shí)，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復凍融。
4、樣本采集、處理、運輸及保存不當時(shí)，可因病毒RNA降解出現假陰性結果，也可因為樣本“污染”出現假陽(yáng)性結果。
四、PCR檢測
(一)樣本處理
樣本的核酸提取應當在樣本處理區進(jìn)行。按所采用的商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，取適量待檢樣本、陽(yáng)性及陰性對照進(jìn)行核酸提取。樣本應盡可能新鮮，提取過(guò)程應嚴防RNA酶污染及操作不當導致的RNA降解。提取過(guò)程如涉及離心步驟，應采用低溫冷凍離心機;在生物安全柜內進(jìn)行加樣、提取過(guò)程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤(pán)內平鋪的碎冰上。提取好的RNA應及時(shí)用于檢測，否則應當-70℃保存。如無(wú)-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。
(二)試劑準備
試劑準備應當在試劑準備區進(jìn)行。根據所用的試劑盒，樣本可進(jìn)行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應當在室溫充分復融，混勻并瞬時(shí)低速離心。反應液分裝時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免管內溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應液的反應管應當扣蓋或裝入密實(shí)袋內再轉移至樣本處理區。
(三)加樣
加樣應當在樣本處理區進(jìn)行。加樣時(shí)應當使樣品完全落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
按試劑、儀器說(shuō)明書(shū)完成加樣和PCR反應管準備。
(四)PCR擴增檢測
PCR擴增檢測在擴增區進(jìn)行。待檢PCR管轉移至擴增區，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說(shuō)明書(shū)設定循環(huán)參數。
(五)結果分析
根據所用試劑盒說(shuō)明書(shū)設置基線(xiàn)值(baseline)。熒光閾值(threshold)設定以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)陰性對照品擴增曲線(xiàn)(無(wú)規則的噪音線(xiàn))的最高點(diǎn)為原則，且Ct值應大于所設置的擴增循環(huán)數(或顯示為undet)。使用儀器配套軟件自動(dòng)分析結果。
(六)質(zhì)量控制
檢測過(guò)程對可能出現的假陽(yáng)性和假陰性進(jìn)行質(zhì)量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽(yáng)性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時(shí)，至少應當有1份弱陽(yáng)性和3份陰性質(zhì)控樣本(多份陰性質(zhì)控樣本設置對實(shí)驗室“污染”所致假陽(yáng)性的監控更為有效)，隨機放在所檢測標本的中間。弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本可為檢測陽(yáng)性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內標”控制假陰性，或弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本來(lái)源困難，可暫不設弱陽(yáng)性質(zhì)控。陰性質(zhì)控樣本采用標本采集管內溶液即可。質(zhì)控樣本應與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過(guò)程。
試劑盒中的陽(yáng)性和陰性對照用于判斷實(shí)驗室的有效性，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
(七)實(shí)驗結果的判定與解釋。
按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對于出現弱陽(yáng)性結果的樣本應進(jìn)行重復檢測，并注意與可能的實(shí)驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽(yáng)性結果區別。
五、檢測結果報告
按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
六、其它注意事項
(一)人感染H7N9禽流感病毒實(shí)驗室活動(dòng)、樣本采集和運輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進(jìn)行管理。從事人感染禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過(guò)生物安全培訓并具備相應的實(shí)驗技能，在檢測過(guò)程中必須采取生物安全防護措施(使用眼罩、N95型口罩等)。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實(shí)驗室，經(jīng)過(guò)年檢合格的二級生物安全柜內進(jìn)行。實(shí)驗室應具有良好的通風(fēng)。
(二)注意儀器設備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設備應進(jìn)行定期校準。試劑盒及一次性使用的無(wú)DNA酶和RNA酶PCR反應管、離心管、帶濾芯吸頭等應進(jìn)行每批質(zhì)檢。
(三)實(shí)驗應嚴格分區操作;各區物品、工作服等均應當專(zhuān)區專(zhuān)用，不得交叉使用。實(shí)驗后應及時(shí)清潔工作臺，以防污染。
(四)每批實(shí)驗室后，可采取實(shí)驗室通風(fēng)、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染。
(五)使用中國疾控中心制備試劑開(kāi)展檢測工作時(shí)，可參考相應試劑盒說(shuō)明書(shū)有關(guān)要求
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