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肝臟去唾液酸糖蛋白受體的發(fā)現及其臨床應用研究
肝臟去唾液酸糖蛋白受體靶向基因藥物對肝臟疾病的治療研究取得了突破性進(jìn)展，下面是小編搜集整理的一篇探究肝臟去唾液酸糖蛋白受體應用的論文范文，歡迎閱讀參考。
肝臟去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoproteinreceptor，ASGPR)，最初由Ashwell及其同伴發(fā)現，由于它能迅速清除血循環(huán)中末端為β-1，4鏈半乳糖的寡糖糖蛋白，因此而被識別和定義[1]。ASGPR主要生理功能是介導血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物質(zhì)的清除，且與病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有著(zhù)密切聯(lián)系。ASGPR的發(fā)現并將之用于臨床，對肝臟疾病的診斷及治療起著(zhù)重要作用[2]：(1)將生物活性分子連接到半乳糖末端，使之高效到達目標組織，進(jìn)行診斷和治療;(2)運用細胞表面特定受體促進(jìn)對受損細胞的修復;(3)監測血清中的去唾液酸糖蛋白，用以評估肝硬化、肝炎、原發(fā)性肝癌患者的肝細胞損傷程度等。
為了提高ASGPR在臨床上的應用價(jià)值，近來(lái)各國學(xué)者對ASGPR的研究也有了更為深刻的突破。
一、SGPR的結構、基因與生理功能
1.結構：ASGPR，也稱(chēng)肝凝集素，是一種異源低聚物內吞受體，數量豐富，主要位于竇狀隙一側的肝細胞膜表面。ASGPR屬于質(zhì)膜上的Ⅱ型跨膜受體，分為四個(gè)功能區：胞質(zhì)區、垮膜區、蒂區和糖識別域(carbohydraterecognitiondomain，CRD);CRD屬于C型(鈣依賴(lài))凝集素的超家族，它能結合去唾液酸的非還原半乳糖殘基和N-乙酰半乳糖胺，增加受體配體的親和性，被認為是ASGPR最重要的部分[3]。
2.基因：ASGPR能被傳統的親和層析法純化。從兔肝分離出大小分別為40kDa和48kDa的蛋白質(zhì)(比例2∶1)，而大鼠肝臟則分別為42kDa，49kDa和54kDa(比例8∶l∶1)，僅人肝細胞和肝癌細胞中的受體分離純化出單一蛋白，大小為46kDa。人HepG2細胞中有兩種ASGPR蛋白(H1和H2)，它們的mRNA近似等量，并以(2～5)∶l的比例被翻譯為主要和次要形式。氨基酸序列暗示H1亞基包含一段約40個(gè)氨基酸的N端胞質(zhì)區，約20個(gè)氨基酸的跨膜區，約80個(gè)氨基酸的胞外莖區以及一段約140個(gè)氨基酸的CRD[4-5]。
3.生理功能：ASGPR大量存在于肝細胞的質(zhì)膜上，并且能被快速內化，這種特性賦予它清除血循環(huán)糖蛋白的巨大潛能，由此管理去唾液酸血清類(lèi)黏蛋白(ASOR)的內穩態(tài)。ASGPR的天然配體由多種半乳糖或半乳糖胺組成，包括脫唾液酸血清類(lèi)黏蛋白、去唾液酸銅藍蛋白、去唾液酸運鐵蛋白[5]，ASGPR通過(guò)識別半乳糖殘基或N-乙酰半乳糖胺而介導ASOR的清除，這一過(guò)程具有高度特異性。
ASGPR的所有亞基都參與了結合配體的功能：在H2缺乏的條件下，H1能被正常運送至細胞表面但卻不能結合ASOR，相反，僅有H2表達的ASGPR會(huì )被迅速分解，不會(huì )到達質(zhì)膜;而H1亞基的表達是H2亞基有效轉運至細胞表面的前提[4]。
二、ASGPR參與相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展
ASGPR可在一定程度上反映有效肝細胞功能，在肝炎、酒精性肝病或肝癌等肝臟疾病發(fā)生時(shí)，其數量和活性均受到損害。受體介導的內吞作用可能是毒性誘導肝損傷的一種新型機制，適當的ASGPR功能和數量能針對各種毒性介導的肝損傷提供保護[6]。根據ASGPR數量及活性的改變，還可預測術(shù)后肝功能代償情況的準確率，李勤濤等[7]就應用ASGPR及臨床指標建立了肝儲備功能定量評估系統，對ASGPR進(jìn)行了進(jìn)一步探索。
1.乙型病毒性肝炎：純化HBV粒子能與HepG2細胞結合，通過(guò)阻斷ASGPR的功能顯著(zhù)抑制兩者結合。乙型肝炎病毒(HBV)preS1相關(guān)的病毒性膜結合位點(diǎn)附著(zhù)于A(yíng)SGPR，HBV由此通過(guò)ASGPR分子進(jìn)入到人體的肝細胞中。胞膜上的preS1和ASGPR具有共同表達區域，它們的表達呈顯著(zhù)的相關(guān)性(Pearsoncorrlection相關(guān)系數為0.776，P<0.0001)。這表明ASGPR可能是介導病毒進(jìn)入宿主細胞的一個(gè)HBV結合伴侶[8]。Diao等發(fā)現ASGPR不僅能與HBV感染肝細胞，還能與其抗體在動(dòng)物體內形成的復合物，誘發(fā)宿主體內的自身免疫反應，使急性乙型肝炎向慢性轉化，加重組織學(xué)損傷[9]。外ASGPRH1亞基的CRD也是甲型肝炎病毒和馬爾堡病毒的入侵位點(diǎn)[10]。
2.慢性酒精性肝�。壕凭嚓P(guān)的肝臟損傷進(jìn)程與酒精誘導的ASGPR含量降低之間存在著(zhù)密切關(guān)聯(lián)。在先前的研究中對離體肝細胞進(jìn)行酒精干預，大量ASGPR位點(diǎn)的內吞過(guò)程受到損害，從配體的結合、內化到分解，乃至受體的再循環(huán)能力都大大降低。在乙醇飼養的野生型大鼠肝細胞中，ASGPR的配體結合、內吞和降解作用減少了45%～50%。慢性酒精干預減少了ASGPR特定的mRNA，使得ASGPR在數量上也大大降低。酒精飼養大鼠的肝細胞還增加了細胞凋亡的敏感性而促使細胞凋亡，最終發(fā)展成為脂肪肝[11-13。
3.原發(fā)性肝癌：有學(xué)者利用組織微陣列技術(shù)探查了一個(gè)相對較大的樣本含量，以檢測ASGPR在正常肝臟和不同等級肝細胞癌中的表達模式和表達量。腫瘤樣本中的總體表達模式比起毗鄰的正常組織來(lái)說(shuō)具有顯著(zhù)不規則性。ASGPR表達水平的免疫組化評分(H-score)顯示，高分化肝細胞肝癌(HCC)的ASGPR表達水平與毗鄰正常肝組織相似，而中等分化與低分化HCC的ASGPR表達水平會(huì )降低，與毗鄰的正常肝組織相比，差異具有顯著(zhù)性統計學(xué)意義[5]。有學(xué)者[14]認為ASGPR可能在淋巴細胞的生理調節中具有重要作用：T細胞介導的肝臟損傷敏感性在A(yíng)SGPR缺乏大鼠體內有所增強，適當的ASGPR功能對T細胞介導的肝炎具有保護作用;Grewal等報道，ASGPR在血管性血友病的體內平衡因素中占有一角，還能促進(jìn)鏈球菌肺炎敗血癥的血小板減少癥的發(fā)生[15]。
三、ASGPR顯像劑的研究進(jìn)展
ASGPR的數量和活性與肝實(shí)質(zhì)細胞的功能直接相關(guān)，因此，對ASGPR進(jìn)行定量分析可以對肝臟功能進(jìn)行評估，ASGPR顯像劑實(shí)現了這一構想。
1.99mTc標記的顯像劑：Chang等[16]用高放射化學(xué)純度合成和標記99mTc-MAMA-MGa(lMonovalentgalactoside，單價(jià)半乳糖苷)和99mTc-MAMA-DGal(Divalentgalactoside，雙價(jià)半乳糖苷)，并對正常和肝纖維化大鼠的兩條路徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)microSPECT顯像和生物分布研究，顯示99mTc-MAMA-DGal對肝臟ASGPR具有更高的結合特異性，而且能迅速通過(guò)肝膽系統和腎臟清除系統排泄出體外，說(shuō)明99mTc-MAMA-DGal也能被用作非侵入性評價(jià)ASGPR相關(guān)肝臟功能障礙的單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(single-photonemissioncomputedtomography，SPECT)探針。另外Sugahara等[17]首次針對急性肝炎(acutehepatitis，AH)和爆發(fā)性肝功能衰竭(fulminanthepaticfailure，FHF)的區域ASGPR表達進(jìn)行99mTc-半乳糖化人血白蛋白(galactosyl-humanerumalbumin，GSA)SPECT分析，這對檢測區域肝損害的嚴重性和評價(jià)區域肝再生具有臨床意義。全肝對99mTc-GSA的肝臟攝取率(liveruptakeratio，LUR)及肝吸收密度(liveruptakedensity，LUD)與肝儲備功能和總膽紅素水平具有良好相關(guān)性，且右葉的LUR、LUD水平與這些參數的相關(guān)性更為顯著(zhù)。全肝和肝左右葉的LUR及LUD的降低程度與急性肝損傷的嚴重性是一致的，而在FHF中，右葉LUR和LUD的減少比左葉更為顯著(zhù)。無(wú)論是AH還是FHF，ASGPR在右葉中的表達比左葉更為迅速。龍彥軍等[18]制備出99mTc標記的殼聚糖-乳糖酸復合物(99mTc-LA-CS)，并觀(guān)察了99mTc-LA-CS在正常裸鼠體內的生物分布情況及去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)介導的肝細胞靶向作用，結果發(fā)現放射性核素99mTc標記的LA-CS在肝細胞中具有特異性攝取，提示99mTc-LA-CS可以作為ASGP-R介導的肝臟顯像劑用于肝細胞成像。Ohno等[19]還引入獨特的參數在99mTc-GSA閃爍法中，即平均傳輸時(shí)間(meantransittime，MTT)和功能顯像，能使我們定量和可視化地闡明肝細胞的區域動(dòng)態(tài)功能。
2.18F標記的顯像劑：Kao等[20]對18F-FBHGal進(jìn)行了研究。它是一種新型的18F標記的單價(jià)半乳糖衍生物，是正常以及肝纖維化大鼠模型的ASGPR特異性PET探針。研究顯示纖維化肝臟中的18F-FBHGal積累比正常肝臟有著(zhù)顯著(zhù)性的降低，因此能對ASGPR相關(guān)的肝臟功能紊亂提供新的見(jiàn)解。
3.188Re標記的顯像劑：Cheng等[21]研制并標記了一種新型的糖肽衍生物188Re-OCTAM。他利用血吸蟲(chóng)感染大鼠實(shí)驗來(lái)評價(jià)OCTAM評估殘余肝功能的潛力，并對不同感染水平的大鼠進(jìn)行肝功能評分。病理和生化分析證實(shí)感染引發(fā)的漸進(jìn)性積累肝損傷能影響肝臟對188Re-OCTAM的攝取，這說(shuō)明同位素標記的OCTAM可能具備評估血吸蟲(chóng)肝功能的顯像劑的潛力。
4.MRI造影劑半乳糖化錳鐵氧體納米粒子(G-MFNP)：錳鐵氧體納米粒子(manganeseferritenanoparticles，MFNP)能被作為診斷癌癥的超敏感的MRI造影劑，它具有強烈的MR對比效應，比氧化鐵納米顆粒增加了160%。Yang等[22]制備出ASGPR靶向性顯影劑G-MFNP，它能特異性靶向結合表達ASGPR的HepG2細胞。
5.超聲造影劑：Kaneko等[23]發(fā)現ASGPR靶向超聲造影劑中的微泡在高機械指數的作用下可破裂并產(chǎn)生信號強度，此信號強度可以反映肝纖維化的嚴重程度。余進(jìn)洪等[24]制備出ASGPR液態(tài)氟碳靶向納米脂質(zhì)造影劑，通過(guò)超聲造影檢查能在體無(wú)創(chuàng )地評價(jià)ASGPR表達量的變化，有利于評估肝臟功能。
近來(lái)，帶有半乳糖基的超支化聚酰胺納米粒子、白蛋白納米粒子、量子點(diǎn)、氧化鐵顆粒也在肝臟靶向顯影中得到研究。Abe等[25]也制備出帶有不同穩定性和清除率的新型構造，包括125I、99mTc、153Gd和111In標記的去唾液酸糖蛋白，它們不同的攝取率和清除率能用來(lái)確定肝臟和移植肝細胞的功能活動(dòng)性。
四、ASGPR的基因及藥物靶向性研究
ASGPR跨膜引入大分子的能力使之成為一個(gè)靶向藥物至肝細胞或肝癌細胞的首選目標[26]。Rozema等證實(shí)了乙酰半乳糖胺共軛的siRNA分子僅僅聚集在肝細胞中，使得ASGPR靶向的概念也有據可循[5]。靶向性治療策略要求抗體-藥劑的結合物針對性的輸送至腫瘤細胞。Coulstock等[27]將IFN-α融合至ASGPR特異性抗體上，合成的融合蛋白(mIFNα2-ASGPRdAb)對肝臟具有更加顯著(zhù)的靶向功能。這樣對肝臟特定區域進(jìn)行藥物治療便能減少血液和周邊組織對干擾素的暴露，以此增加干擾素治療的安全性和耐受性;Zhao等[26]將蜂毒素轉染至一個(gè)抗ASGPR的單鏈可變片段抗體，構建成一個(gè)重組的免疫毒素，對肝腫瘤細胞進(jìn)行靶向溶解。
目前報道的最有效的一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因遞送系統是脂質(zhì)魚(yú)精蛋白DNA(LPDs)，它具有比傳統脂質(zhì)體更優(yōu)越的基因傳送能力，Lu等[28]據此制備出新型膽固醇衍生物組成的LPDs，進(jìn)行肝細胞靶向基因送達;Díez等[29]研發(fā)了一種新型的靶向性陽(yáng)離子納米粒子系統，由PLGA[poly(D，L-lactic-co-glycolicacid)]、DOTAP[1，2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane]和去唾液酸糖蛋白(asialofetuin，AF)組成，是一種靶向基因至肝腫瘤細胞的高效配方，載有治療基因IL-12的納米粒子具有很高的血清濃度，這可能會(huì )成為體內應用的潛在系統;Valenttijn等[30]也通過(guò)一種固相合成手段合成了一系列群集半乳糖苷YEE(ah-GalNAc)3類(lèi)似物，即YEEE(a-ah-GalNAc)3，它允許裝載治療性化合物、熒光物質(zhì)，并能對肝臟進(jìn)行選擇性遞送，可作為一個(gè)有效的載藥或載基因配體。
Guhagarkar等[31]探討了采用聚葵二酸酯阿霉素納米粒子(PES-DOXNP)作為ASGPR配體進(jìn)行肝靶向的研究。它們采用納米沉淀技術(shù)獲得具有高截留效率和高藥物加載的納米粒子，賦予它長(cháng)時(shí)間循環(huán)特性和增強的靶向能力，以此提高肝癌的治療效果。Ma[32]研制了一種shRNA(pGenesil-siHBV4)，能夠有效抑制人肝癌細胞HepG2.2.15中的HBV復制，減少HBV的mRNA水平，HBsAg和HBeAg的蛋白水平以及分泌型HBVDNA;這種新型shRNAs的肝ASGPR靶向策略是一種能夠高度特異性抑制HBV復制和消除肝癌細胞的方法。
Peng等[33]報道了一種將凋亡蛋白基因連接在A(yíng)SOR上的系統性運載工具，它能靶向肝細胞表面的ASGPR。對帶有原位肝癌的大鼠進(jìn)行尾靜脈注射ASOR-凋亡蛋白，肝癌細胞和正常肝細胞均可發(fā)現凋亡蛋白的分布，注射5d過(guò)后，原位肝癌顯示了明顯的衰退信號，而周?chē)８渭毎麉s沒(méi)有。ASOR-凋亡蛋白全身給藥能特異性誘導惡性肝細胞的凋亡，因此構成了一種針對肝細胞癌的強力且安全的療法。
五、ASGPR應用的前景及展望
ASGPR為肝臟定向轉移的最佳受體，為肝臟疾病的治療、肝功能的檢測和肝臟基因的定向表達提供了良好的途徑。ASGPR顯影能對肝功能進(jìn)行正確評估，幫助預測手術(shù)風(fēng)險、制定合適的治療方案、降低肝臟手術(shù)的圍手術(shù)期死亡率，但在顯影劑的制備上還存在穩定性、組織通透性等缺陷。
ASGPR靶向基因藥物對肝臟疾病的治療研究也取得了突破性進(jìn)展，但對于復合物的制備也有很大的不足，比如大小和濃度的缺陷都會(huì )限制其應用。相信隨著(zhù)生物技術(shù)的發(fā)展，這些問(wèn)題都能逐個(gè)解決，ASGPR顯像劑及ASGPR介導的基因和藥物轉移技術(shù)擁有著(zhù)廣闊的應用前景。
參考文獻
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