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VP22融合型顯性負性突變體抑制乙肝病毒復制
作者：易軍，宮衛東，王嶺，凌瑞，陳江浩，王輝，王廷
【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒
Inhibition of hepatitis B virus replication by dominant negative mutant of VP22 fusion protein
【Abstract】 AIM: To investigate the inhibitory effect on hepatitis B virus (HBV) replication with dominant negative (DN) mutant of VP22 fusion protein. METHODS: Fulllength or fractions of VP22 were fused to C terminal of HBV core protein (HBc), and cloned into pcDNA3.1(-) vector, yielding eukaryotic expression plasmids of DN mutant. After transfection into HepG2.2.15 cells, the expression of DN mutant was identified by immunofluorescence staining. The inhibitory effect of DN mutant on HBV replication was indexed as the concentration of HBV surface antigen (HBsAg) in the supernatant of cell culture. And MTT assay was performed to detect the cytotoxicity of transgene expression to the host cells. RESULTS: DN mutant of VP22 and its fractions could be expressed in HepG2.2.15 cells, and had no toxic effect on the host cells. The DN mutant could inhibit HBV replication, and the mutant with protein transduction ability had a stronger inhibition than that without. The DN mutant of fulllength VP22 had the strongest inhibitory effect, reducing the HBsAg concentration by 81.94%. CONCLUSION: DN mutant of VP22 fusion protein can enhance the inhibition of HBV replication.
【Keywords】hepatitis B virus; dominant negative mutant; VP22
【摘要】 目的： 了解VP22融合型顯性負性(DN)突變體對抑制乙肝病毒(HBV)復制的作用. 方法： 將VP22全長(cháng)及其不同區段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端，克隆入pcDNA3.1(-)構成DN突變體真核表達質(zhì)粒. 轉染HepG2.2.15細胞后，免疫熒光鑒定DN突變體在細胞內的表達，并以培養上清HBV表面抗原(HBsAg)的濃度為指標，觀(guān)察DN突變體對HBV病毒復制的抑制效應. 同時(shí)以MTT比色法觀(guān)察轉基因的表達對宿主細胞生長(cháng)狀態(tài)的影響. 結果： VP22及其不同區段構建的DN突變體可在HepG2.2.15細胞中進(jìn)行表達，且對宿主細胞無(wú)毒性. VP22融合型DN突變體可有效地抑制HBV的復制，具有蛋白轉導特性的DN突變體比無(wú)轉導特性的DN突變體具有更強的抗病毒能力. 其中VP22全長(cháng)構成的DN突變體具有最強的抑制效應，可使上清HBsAg濃度下降81.94%. 結論： VP22融合型DN突變體可以增強DN突變體對HBV復制的抑制.
【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒，乙型；顯性負性突變體；VP22
0引言
全球目前有3.5億慢性乙型肝炎病毒（hepatitis virus B, HBV）感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染的相關(guān)疾病，占疾病死因的第9位［1］. 目前，國際上尚無(wú)有效治療慢性乙肝的手段. 基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展為抗HBV治療提供了新的思路和途徑. 其中顯性負性(dominant negative，DN)突變體的胞內表達是HBV基因治療的重要策略之一［2-6］. Elliott等［7］發(fā)現，單純皰疹病毒1(herpes simplex virus type 1, HSV1)的結構蛋白VP22(及其融合蛋白)可從培養基進(jìn)入細胞內，并可不經(jīng)過(guò)細胞細胞接觸依賴(lài)性在同型或異型細胞之間轉移. 我們將HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)與VP22進(jìn)行融合構成DN突變體，以期利用VP22的蛋白轉導特性進(jìn)一步提高DN突變體的抗病毒效應.
1材料和方法
1.1材料質(zhì)粒pVP22/mycHis2和pcDNA3.1(-)為Invitrogen公司產(chǎn)品；EBOHBV克隆有1.3倍HBV全長(cháng)基因組為本室保存. 限制性?xún)惹忻�、連接酶購自TaKaRa Biotech Co.Ltd；鼠抗HBc抗體和鼠抗cmyc抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品，FITC標記的羊抗鼠IgG為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；DMEM培養基、進(jìn)
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