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壁虎醇提物對小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的抑制作用
【摘要】 目的觀(guān)察壁虎醇提物對小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的作用并探討機制。方法建立免疫功能正常小鼠腎囊膜下移植S180肉瘤模型，將40只雄鼠隨機分為陰性對照生理鹽水組、陽(yáng)性對照環(huán)磷酰胺組(0.1 g·kg-1)、壁虎醇提物高劑量組(2.4 g·kg-1)、壁虎醇提物低劑量組(1.2 g·kg-1)共4組。腹腔注射給藥6 d后,殺鼠稱(chēng)量荷瘤小鼠體重，評價(jià)藥物對小鼠毒性;測量小鼠肉瘤體積，稱(chēng)取移植瘤小鼠胸腺重、脾臟重，計算抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數;用SABC免疫組化法檢測血管內皮生長(cháng)因子(VEGF)的表達。結果壁虎醇提物可抑制小鼠肉瘤S180生長(cháng),環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高劑量組、壁虎醇提物低劑量組抑瘤率分別為74.5%，77.5%，57.5%，且各組末體重/初體重分別為0.94，1.03，0.99;壁虎醇提物對免疫器官無(wú)影響，而環(huán)磷酰胺組胸腺指數、脾臟指數與陰性對照組比則有明顯的統計學(xué)差異(P<0.05);免疫組化顯示環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組與生理鹽水組比較VEGF蛋白的表達明顯減少。結論壁虎醇提物有抗腫瘤活性,其抗腫瘤的部分作用可能通過(guò)抑制腫瘤血管的生成而實(shí)現 。
【關(guān)鍵詞】 壁虎醇提物; 血管內皮生長(cháng)因子; 腎包膜; S180肉瘤
壁虎又稱(chēng)為守宮、天龍等，為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther或其他幾種壁虎除去內臟的全體，是傳統的咸寒軟堅中藥，具有祛風(fēng)、定驚、散結、解毒的功效。大量研究報道壁虎有顯著(zhù)的抗腫瘤作用。本課題組前期實(shí)驗也證實(shí)中藥壁虎對食管癌細胞和S180荷瘤小鼠具有確切的抑制作用[1～3]。但壁虎成分十分復雜，究竟是何種成分發(fā)揮抗腫瘤作用，目前還不清楚，本課題組從干壁虎中提取得到壁虎醇提物，發(fā)現該醇提物可以抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤生長(cháng)。
1 材料與儀器
1.1 壁虎醇提物的制備及試劑加工過(guò)程：干無(wú)蹼壁虎1 000 g粉碎為粗粉，置于4 000 ml Tris-HCl緩沖液中(pH=7.4)，浸泡過(guò)夜，超聲細胞破碎，11 000 r·min-1離心，取上清，加無(wú)水乙醇至終濃度為55%，放4℃冰箱中，每20~30 min攪拌1次，4 h后11 000 r·min-1離心，取上清，真空旋轉蒸發(fā)回收乙醇，最終冷凍干燥。環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫藥有限公司)。含15%胎牛血清RPMI-1640 培養液。VEGF免疫組化染色試劑盒(福州邁新生物科技開(kāi)發(fā)有限公司)。
1.2 動(dòng)物及瘤株試驗所用昆明種小鼠由河南科技大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供(合格證:0001350 )，體質(zhì)量(26±3) g,均為雄鼠。S180腹水小鼠由河南省醫科所提供。
1.3 儀器游標卡尺(廣西桂林量具刃具廠(chǎng));高速冷凍離心機(江蘇省太倉市華美生化儀器廠(chǎng));萬(wàn)分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);冷凍干燥儀(德國MARTIN CHRIST公司);旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司)。
2 方法
2.1 腎包膜下移植S180肉瘤模型建立將S180腹水小鼠抽出腹腔積液離心洗2 次,用無(wú)菌生理鹽水液稀釋成1 ×107 個(gè)/ ml的肉瘤細胞懸液。在小鼠右前腋下接種0. 2 ml肉瘤細胞懸液。7 d后，殺鼠取瘤。將腋下接種的S180肉瘤標本, 于超凈工作臺剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 大小之瘤塊, 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液中,冰浴存放備用。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉，按0.2 ml/100 g動(dòng)物體重麻醉小鼠。小鼠取俯臥位,常規消毒后從右側腎臟部位平行脊椎切開(kāi)一約1 cm 的切口,托出腎臟。以眼科鑷輕提腎囊膜,以自制接種器將S180肉瘤組織小塊接種于腎囊膜下。還納腎臟于體內,分層縫合肌層及皮膚層。
2.2 壁虎醇提物對荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用觀(guān)察將40只動(dòng)物隨機分成4組，生理鹽水對照組、CTX組、壁虎醇提物高(2. 4 g/kg)、低(1.2 g/kg) 劑量組共4組,每組各10只,根據體重按0.1 ml/10 g自術(shù)后開(kāi)始腹腔注射，CTX組第1天注射1次，其余組均1 d/次，給藥6 d后,稱(chēng)鼠重，處死小鼠,打開(kāi)腹腔, 以游標卡尺測量瘤體長(cháng)徑(a)與寬徑(b), 計算瘤體大小(TS)，瘤塊生長(cháng)的△TS值和抑制率：TS= ab2/ 2 △TS= 末體積 - 初體積抑制率( %) = (1- 用藥組瘤體變化/ 對照組瘤體變化) ×100%
2.3 藥物毒性觀(guān)察以小鼠被處死前的體重(FBW) 與給藥前的體重(IBW) 之比值作為判定藥物對荷瘤小鼠毒性的指標。FBW/IBW≥0.80, 則認為所測藥物毒性較小。
2.4 壁虎醇提物對荷瘤小鼠免疫器官的影響 按上述方法給藥6 d后，處死動(dòng)物取胸腺，脾臟稱(chēng)重。胸腺指數=胸腺重/體質(zhì)量，脾臟指數=脾臟重/體質(zhì)量。
2.5 小鼠S180肉瘤組織病理學(xué)變化腫瘤組織用10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,常規HE染色,光鏡觀(guān)察肉瘤組織病理變化。
2.6 VEGF蛋白表達的檢測用SABC免疫組化法,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。VEGF判定與分析：凡細胞漿、細胞膜出現棕黃色顆�；蚓|(zhì)樣棕黃色結構者為VEGF免疫反應陽(yáng)性細胞。免疫組化染色評分標準是：根據著(zhù)色細胞的比例(染色范圍)及染色強度，染色范圍(陽(yáng)性細胞比率)分為0～4級，陰性為0分;陽(yáng)性細胞1%～25%為1分;25%～50%為2分;51%～75%為3分;76%～100%為4分。染色強度劃分為0～3級,陰性為0分;弱陽(yáng)性為1分;中等強度為2分;強陽(yáng)性為3分;兩者得分相加為最后得分。
2.7 統計方法運用SPSS 統計軟件，采用單測t檢驗。
3 結果
3.1 壁虎醇提物對荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用及毒性反應環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物高、低組抑瘤率分別為74.5%，77.5%，57.5%，與模型組比較有統計學(xué)差異(P<0.01)，且毒性反應小。結果見(jiàn)表1表1 各組對小鼠S180肉瘤的抑制作用
3.2 壁虎醇提物對荷瘤小鼠免疫器官的影響 CTX組與對照組相比，胸腺指數與脾臟指數明顯降低(P<0.05),壁虎醇提物各劑量組與對照組相比無(wú)明顯差異，結果見(jiàn)表2表2 各組對荷瘤小鼠免疫功能的影響 3.3 移植瘤組織病理學(xué)變化經(jīng)HE染色后先在低倍鏡下觀(guān)察，然后在高倍鏡下(400×)觀(guān)察,陰性對照組癌細胞大小和形態(tài)不一致,細胞染色較深,癌細胞核體積增大,細胞核和細胞漿比例增大，核的大小、形狀、染色不一，核染色深。核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，分布不均勻，核仁大，數目增多，核分裂相增多，可見(jiàn)不對稱(chēng)性、多極性及頓挫性等病理性核分裂相，且癌組織間微血管豐富;環(huán)磷酰胺組有大片的細胞壞死區，壁虎各組均可見(jiàn)不同程度的片狀壞死區，瘤組織內及其周?chē)⒀芫鶞p少。
3.4 壁虎對小鼠移植S180肉瘤組織VEGF蛋白表達的影響免疫組化結果顯示VEGF蛋白在S180肉瘤組織中呈高表達，主要表達于細胞的胞漿和包膜，環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組對VEGF的表達有明顯的抑制。結果見(jiàn)表3及圖1表3 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達
4 討論
從中藥中篩選有效的抗腫瘤藥物已成為國際上發(fā)現抗腫瘤藥物的重要途徑，不僅經(jīng)濟，療效可靠，還可以為設計更為理想的新藥提供新的化學(xué)結構，成為創(chuàng )制新藥的先導化合物。壁虎是中國傳統的中藥材，具有攻毒療瘡、散結止疼、活血化淤的功效，目前尚未被《中國藥典》收入，壁虎在臨床被廣泛地用于治療多種疾病，對腫瘤特別是食管癌，胃癌，肝癌等實(shí)體瘤具有獨特的療效[4，5]。本實(shí)驗組提取的壁虎醇提物能顯著(zhù)的抑制小鼠腎包膜下移植S180肉瘤的生長(cháng)，壁虎醇提物高、低劑量組抑瘤率可達到77.5% ，57.5%。研究同時(shí)本研究又對壁虎高、低劑量組的胸腺指數和脾臟指數與對照組進(jìn)行比較，結果顯示無(wú)明顯差異，而CTX組與對照組比較下降明顯。并且由FBW/IBW 結果顯示壁虎醇提物的毒性小。為探討壁虎醇提物抑制腫瘤生長(cháng)的機制，我們進(jìn)一步研究其對血管生成的影響。腫瘤組織內血管形成是受機體內促血管生成細胞因子和抑制血管內皮細胞因子相互作用的結果，VEGF是體內促進(jìn)血管生成的主要的細胞因子[6]。在腫瘤的血管生成過(guò)程中，VEGF不僅促進(jìn)已經(jīng)存在的血管系統的內皮細胞的生長(cháng)，遷移和存活，而且還動(dòng)員骨髓內的內皮祖細胞釋放入外周血，抑制VEGF可以降低腫瘤內微血管的生成[7，8]。本實(shí)驗組進(jìn)行了VEGF蛋白表達的檢測，結果表明與陰性對照組比，環(huán)磷酰胺組、壁虎醇提物組VEGF蛋白表達均降低�？梢�(jiàn)壁虎醇提物抗腫瘤機制并不是通過(guò)增加機體的免疫力起作用，其機制可能與降低了VEGF蛋白的表達有關(guān)。
圖1 各組小鼠S180肉瘤組織VEGF蛋白表達(400×)
目前對無(wú)蹼壁虎抗腫瘤的活性成分研究較少。研究表明壁虎含有組織胺類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素，含維生素C、維生素D、脂肪、粗纖維、胡蘿卜素等[9]。無(wú)蹼壁虎抗腫瘤活性成分含有多種物質(zhì)，但其抗腫瘤的有效成分究竟是何物，有待結合藥物化學(xué)進(jìn)行深入研究, 此外是否存在更多的作用靶點(diǎn)也有待于進(jìn)一步深入研究。
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