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放射性碘標記羥氨芐青霉素用于青霉素結合蛋白的研究
論文關(guān)鍵詞 青霉素結合蛋白，放射性，經(jīng)氨葦青霉素多頭泡噬厲，Mecillinam
論文摘要 本文報道用放射性對經(jīng)氨節青霉素進(jìn)行標記后用于青霉素結合蛋白(PBPs)的研究。結果表明，一經(jīng)氨節青霉素能較好地與細菌內膜上所有的青霉素結合蛋白結合。進(jìn)行競爭性結合實(shí)驗，頭抱嘎肪的主要靶位是PBP3，Mecnhnam的主要靶位是PBP:。我們建立的青霉素結合蛋白的測定方法，關(guān)鍵性的價(jià)廉易得，具有簡(jiǎn)便、快速、等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)值得繼續開(kāi)發(fā)和研究的新途徑。
青霉素結合蛋白是存在于細菌被膜上一群能同青霉素和其它盡內酞胺類(lèi)抗生素贅合的細菌蛋白，從分子水平上對青霉素結合蛋白的研究，對于探討刀一內酞胺類(lèi)抗生素的作用機制和闡明某些細菌的耐機制具有重要的意義，國內外已進(jìn)行了多方面的研究（1-5）。我們從大腸桿菌K:，中提取細菌膜蛋白，利用放射性’腸碘建立了細菌青霉素結合蛋自的檢測方法，現報告如下。
實(shí)驗材料
一、抗生素:
經(jīng)氨節青霉素(Amox了eillin)，頭抱唾肪(Cefotaxime)和Meeillinam均為市售產(chǎn)品。
二、菌株:
大腸桿菌K12、:為北京生物制品檢定所提供。
三、培養基:
采用抗Ⅲ號培養基。
四、放射源:
一Nal由北京原子能所提供。
實(shí)驗方法
一、一裊氛節青霉素的制備:
采用氯胺一T法，在參考Masson等（6）的基礎上加以改進(jìn)。、氫氨節青霉素20拌g和氯胺一混合，在室溫條件下反應60~90秒后加入偏重亞硫酸鈉和碘化鉀完成整個(gè)反應，將標記品稀釋至反應所需濃度后放入O~4℃存放。
二、結合反應:
細菌培養及膜的制備參照Spratt等（7）的方法制得。在反應管中加入提取的膜蛋自一經(jīng)氨節青霉素，30℃溫育10分鐘，加入青霉素Go.6mg，20%的+二烷基肌氨酸10川，室溫下放置20分鐘，離心100，。009x4。分鐘，將上清液、樣品緩沖液和琉基乙醇按6:3:1的比例混合，沸水浴3分鐘，冷卻后經(jīng)SDS一PAGE分離。
標記品和其它待測抗生素與膜蛋白的競爭性結合反應參照Curltis等c7，的方法進(jìn)行。待測抗生素頭抱唾肪與Micillinam分別與膜蛋自在30℃反應10分鐘后加入一經(jīng)氨節青霉素，以后的過(guò)程與上述一致。
三、凝膠處理和放射自顯影:
將電泳后的凝膠立即進(jìn)行固定、染色和脫色處理，用凝膠干燥器進(jìn)行真空干燥。干燥后的凝膠與x光片緊密接觸后在一70℃條件下曝光5-7天。
實(shí)驗結果
一、標記品的鑒定:
我們對標記品用薄層層析法進(jìn)行分析，如Fig.1所示。結果顯示: 氫氨節青霉素與非標記經(jīng)氨節青霉素的移動(dòng)位置一致，游離的不超過(guò)10%。經(jīng)以后的結合實(shí)驗證實(shí)，在此標記條件下盡內酞胺環(huán)是穩定的。
二、結合實(shí)驗:
用Sarkosyl一可溶部分(內膜)、Sarkosyl一不溶部分(外膜)和整個(gè)細胞外被電泳后進(jìn)行放射自顯影觀(guān)察。結果顯示，經(jīng)氨節青霉素與內膜和整個(gè)細胞外被的青霉素結合蛋白的結合情況一致，其放射自顯影帶的位置符合報道的青霉素結合蛋白的分子量(用標準分子量蛋白做對照)，如Fig.2。標記品與外膜反應后未出現任何自顯影帶，說(shuō)明細菌外膜無(wú)青霉素結合蛋白存在。
用頭抱唾肘和Mieillinam分別與一經(jīng)氨節青霉素、細菌內膜蛋白進(jìn)行競爭性結合實(shí)驗，結果見(jiàn)Fig.3。從中可見(jiàn)，頭抱噴厲的特異靶位是PBP:，而Micillinam的特異靶位是PBP3，與文獻報道的結果相符（8）。
[1]
討論
由于青霉素G與所有青霉素結合蛋白都具有良好的結合，所以，目前大家都采用其標記物作為研究工具。，4C一PenieillinG(PCG)是目前應用最為廣泛的標記品，但此標記品的比放低(1.45~2.22火10一SBq/mol)，這就造成了標記品用量大且曝光時(shí)間太長(cháng)，既使在使用熒光閃爍法(Flurograp-hy)、預曝光(Prefog義ing)和超低溫(一700C)條件下曝光等這些快速自顯影方法，仍需要20一，60天（9-11）。采用氛標記法提高比放，由于莊內酞胺環(huán)的不穩定性，幅射 自分解快，所以不能作為商品出售�，F在必須進(jìn)口，價(jià)格昂貴。
用標記多膚類(lèi)激素和蛋白質(zhì)已有大量的資料報道，但用于標記冬內酞胺類(lèi)抗生素的卻很少。由于許多壓內酞胺類(lèi)抗生素具有類(lèi)似酪氨酸殘基的結構成分對位經(jīng)基使苯環(huán)上的氫原子活躍易被取代(如經(jīng)氨節青霉素)，使放射性碘標記能夠進(jìn)行。而青霉素G苯環(huán)的結構特性則不適用于放射性碘標記。
我們制備的一經(jīng)氨節青霉素，由于其比放射性高(約Bq/mol)，即使不使用熒光閃爍法和預曝光，自顯影亦縮至1周左右，大大加快了整個(gè)實(shí)驗周期。整個(gè)標記過(guò)程簡(jiǎn)便易行，重復性好，標記完后不需要特殊分離手段(電泳過(guò)程中自動(dòng)分離)。更為重要的是解決了標記品的供給，為整個(gè)實(shí)驗節約大量經(jīng)費，并為其研究在國內提供了一個(gè)新的技術(shù)方法。
參考文獻
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（10）Bonner WM et al; Eur J Biochem 1974: 46: 83-88
（11）Laskey RA. et ale Eur J Biochem 1975: 56: 335-341
[2]
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