痛平膏主要藥理作用實(shí)驗研究

曹春然，周建平，王志斌                                                                                                     【摘要】  目的  觀(guān)察痛平膏的主要理作用，為應用提供實(shí)驗依據。方法  用熱板法、醋酸法致疼痛小鼠模型，觀(guān)察其鎮痛作用；用角叉菜膠、二甲苯致大、小鼠急性炎癥模型，考察其抗炎作用；采用葡聚糖致微循環(huán)障礙小鼠模型，研究痛平膏的活血作用。結果  痛平膏可提高動(dòng)物因熱刺激致痛的痛閾值，減少因醋酸刺激而發(fā)生扭體反應的動(dòng)物只數；對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹有抑制作用，可減輕二甲苯致小鼠耳腫脹的腫脹度；對靜脈注射葡聚糖溶液引起的小鼠微循環(huán)障礙，有明顯的改善作用。結論  痛平膏具有鎮痛、抗炎和活血的藥理作用。
   
    【關(guān)鍵詞】  痛平膏；  鎮痛作用；  抗炎作用；  活血作用
    
        【Abstract】  Objective  To study the principal pharmcodynamics of  Tongping ointment and provide experimental data for clinical application. Methods  Methods of acetic acid-induced writhing and hot-plate test in mice were used to study the analgesic effect. Models of acute inflammatory reactions of xylene-induced mouse ear edema and carrageen-pastern-induced rat paw edema were performed to study the anti-inflammatory effects. To prepare the model of mouse ears microcirculatory disturbance by intravenous injection of dextran solution for observing promoting blood circulation effect of Tongping ointment. Results  The pain threshold was remarkably improved and the number of  writhing mice induced by acetic acid were decreased. Tongping ointment significantly suppressed carrageen-pastern-induced rat paw edema and xylene-induced mouse ear edema. The microcirculatory disturbance induced by injecting dextran solution was ameliorated markedly. Conclusion  Tongping ointment manifested analgesic effect，anti-inflammatory and promoting blood circulation effects obviously.
    
        
    痛平膏是由骨碎補、防風(fēng)、乳香、沒(méi)藥等多味組成的外用中藥復方制劑。具有舒筋活血、祛風(fēng)散寒、消腫止痛的功效。臨床可用于頸椎、關(guān)節痛、風(fēng)濕痛、骨質(zhì)增生痛等癥。為獲得臨床用藥的實(shí)驗依據，采用動(dòng)物模型觀(guān)察其鎮痛、抗炎和活血作用。
   
    1 
   
    1.1  動(dòng)物  SD品系大鼠，SPF級，♂，140±10g，由北京維通利華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2002－0003；ICR品系小鼠，SPF級，♀♂，體重19±1g、28±1g（♂，用于抗炎試驗），由北京維通利華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；昆明種小鼠，SPF級，♀♂，體重19±1g，由中國藥品生物制品檢定所提供，許可證號：SCXK 11－00－0010。
   
    1.2  藥品、試劑  痛平膏，批號：020801，由北京百草藥業(yè)提供；扶他林乳劑，批號：01193，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)；酸痛靈噴劑，批號：XSH00200，廈
    
        
    1.3  儀器  熱板測痛儀，型號：GJ-8402 ，由浙江寧海白石儀器廠(chǎng)生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，型號：XSZ-H，重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)。
   
    2  方法及結果
   
    2.1  分組及給藥  動(dòng)物分為痛平膏大、中和小劑量組、空白對照組、酸痛靈噴劑組、扶他林乳劑組。痛平膏各組劑量分別為0.36、0.18和0.09g生藥/cm2，酸痛靈噴劑組為0.36ml/cm2，扶他林乳劑組為0.1g/cm2，空白對照組給予生理鹽水。
   
    2.2  鎮痛試驗
   
    2.2.1  對熱板法致小鼠疼痛的影響［1］  　因雄性小鼠受熱陰囊觸及熱板，可出現假性結果，所以本試驗采用雌性小鼠。本次試驗采用一次性給予動(dòng)物供試品及對照品，觀(guān)察其藥理作用。
    
    取體重為19±1g的ICR種小鼠，♀，健康。試驗前1日，先篩選合格小鼠，每次1只放在加熱至恒溫的鐵板（55℃）上，小鼠自放在熱板上，至出現因熱刺激而舔后足所需的時(shí)間（s），作為該鼠的痛閾值，出現舔足反應后將小鼠取下。凡舔后足時(shí)間小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用。間隔1h，重復測定其正常痛閾值，取兩次正常痛閾平均值，作為該鼠的給藥前基礎痛閾值，以平均值不超過(guò)30s為合格。將合格小鼠隨機分為6組，并將小鼠背部的被毛去除（面積約1cm2）。試驗當日，將適量供試品及對照品涂抹于橡皮膏上，固定在小鼠的背部，以不影響其舔后足為度。在給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)，將小鼠放在加熱至恒溫（55℃）的鐵板上，觀(guān)察其發(fā)生因熱刺激而出現的舔足反應時(shí)間，小鼠出現舔足反應后，迅速將小鼠取下，以避免燙傷。痛閾值測定時(shí)間點(diǎn)分別為給藥后0.5、1、2、4、6h。本試驗觀(guān)察受試物的鎮痛作用及時(shí)效關(guān)系。以受試動(dòng)物出現因熱刺激而舔后足反應的時(shí)間（痛閾值）為觀(guān)察指標，對所得的試驗數據采用t進(jìn)行。同時(shí)按下式計算各劑量組動(dòng)物鎮痛百分率。結果見(jiàn)表1。
   
    鎮痛百分率=給藥組動(dòng)物痛閾值-空白對照組動(dòng)物痛閾值〖〗空白對照組運動(dòng)痛閾值×100%

表1  痛平膏對熱板法致小鼠疼痛模型的影響   (x±s，n=10)

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01，括號內為各給藥組動(dòng)物的鎮痛百分率。

    2.2.2  對醋酸致小鼠疼痛的影響［1］  取體重為19±1g的ICR種小鼠，♀♂，健康，共84只。本次試驗采用一次性給予動(dòng)物供試品及對照品，觀(guān)察其藥理作用。試驗前1日，將受試動(dòng)物的腹部被毛去除（面積約1cm2）。試驗當日，按體重隨機分成6組，涂抹于橡皮膏上，固定在小鼠的腹部，給藥1h后，將橡皮膏去除，避免影響小鼠的扭體反應。用生理鹽水新鮮配置0.6％的醋酸溶液，按0.1ml/10g的劑量，腹腔注射給予小鼠。以給予醋酸后15min內，各組受試動(dòng)物出現扭體反應的只數為觀(guān)察指標，并進(jìn)行χ2檢驗，與模型對照組比較，組間差異是否有顯著(zhù)性。同時(shí)按下式計算各劑量組動(dòng)物的扭體反應發(fā)生率和鎮痛百分率。結果見(jiàn)表2。
   
    扭體反應發(fā)生率=發(fā)生扭體反應的動(dòng)物數〖〗該組動(dòng)物的總數×100%
   
    鎮痛百分率=模型對照組扭體反應鼠數-給藥組扭體反應鼠數〖〗模型對照組扭體反應鼠數×100%

表2  痛平膏對醋酸致小鼠疼痛模型的影響  （n=14）

注：與模型對照組比較。

   
    2.3  抗炎試驗

    2.3.1  對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響［2］  因目前不能確證性別對炎癥模型的影響，且雌激素有抗炎和免疫抑制作用，故選擇雄性大鼠作為本試驗的受試動(dòng)物。取體重為140±10g的SD種大鼠，♂，健康，共50只。試驗前1日，將試驗用大鼠右后腿內側的被毛去除（面積約1cm2）。試驗當日，按體重隨機分成5組，分別為模型對照組，扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組、小劑量組。分別測量每只大鼠右后肢正常踝關(guān)節周長(cháng)，作為造模前的基礎值。測量正常周長(cháng)后，在右后肢的內側皮膚，分別給予各組動(dòng)物適量受試品和對照品，用橡皮膏固定。給藥30min后，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜混懸液0.1ml/只致炎。在致炎后1、2、4、6h，各測量一次右側踝關(guān)節的周長(cháng)。以各組動(dòng)物致炎后與致炎前的踝關(guān)節周長(cháng)之差（腫脹度）為觀(guān)察指標，采用t檢驗進(jìn)行數據統計，按下式計算腫脹抑制率。結果見(jiàn)表3。
   
    腫脹抑制率=模型對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹率〖〗模型對照組平均腫脹度×100%

表3  痛平膏對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響   (x±s，n=10)

注：與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01，括號內為各給藥組動(dòng)物的腫脹抑制率，“-”表示腫脹度大于模型對照組。

    2.3.2  對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響［2］  取體重為28±1g的ICR種小鼠，♂，健康，共60只。試驗當日，按體重隨機分成5組，分別為模型對照組，扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組、小劑量組。每鼠左耳外側涂100％二甲苯0.02ml致炎，致炎后30min，在致炎的左耳內側，涂抹適量受試品和對照品。致炎2h后，將小鼠斷頸處死，清理剩 余物，沿耳廓基線(xiàn)剪下兩耳，用打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用天平稱(chēng)重。以每鼠的左耳片與右耳片重量之差（腫脹度）為觀(guān)察指標，采用t進(jìn)行數據，與模型對照組比較組間差異的顯著(zhù)性。按下列公式計算腫脹抑制率。結果見(jiàn)表4。
   
    腫脹抑制率=模型對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度〖〗模型對照組平均腫脹度×100%

表4  痛平膏對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響  （x±s，n=10）

注：與模型組比較**P<0.01

    2.4  活血作用試驗［1］  取體重為19±1g的昆明種小鼠，雌雄各半，健康，共60只。試驗共分6組，空白對照組，模型對照組，痛平膏扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組和小劑量組。試驗前1日，將受試小鼠的背部被毛去除（面積約1cm2）。試驗當日，分別給予適量的受試品和對照品，用橡皮膏固定在背部。給藥30min后，用1％戊巴比妥鈉溶液0.05ml/10g腹腔麻醉。剪去耳廓背側的細毛，并將小鼠腹部向下固定在顯微鏡的載物臺上，使鼠耳固定，調節顯微鏡（放大倍數為10×10），直至可以清楚地觀(guān)察小鼠耳廓微循環(huán)情況。固定視野，調節測微尺的位置，使其可以測量血管直徑的變化。給藥35min時(shí)，觀(guān)察小鼠耳廓選定部位的微小動(dòng)、靜脈的管徑，此測定值為造模前基礎值（A、V），并選擇血液流態(tài)相似的微小靜脈，用于觀(guān)察造模后血液流態(tài)的改變。給藥40min時(shí)，除空白對照組動(dòng)物外，均按0.3ml/20g的劑量從尾靜脈注射葡聚糖溶液（25mg/ml），空白對照組給予同體積生理鹽水注射液。分別在造模后10、20、30min時(shí)，連續觀(guān)察小鼠耳部選定的同一位置，記錄微動(dòng)、靜脈管徑及血液流態(tài)的變化。以各組動(dòng)物造模前與造模后的微動(dòng)、靜脈管徑的差值（△A、△V）為觀(guān)察指標，同時(shí)對微靜脈血液的流態(tài)進(jìn)行評分，并作為觀(guān)察指標，對試驗所得數據進(jìn)行t檢驗。評分的標準見(jiàn)表5

表5  微靜脈血液的流態(tài)評分標準

    分值流態(tài)評定標準4分線(xiàn)粒流血流快速，成直線(xiàn)，但有沙粒感3分粒線(xiàn)流血流較快，成直線(xiàn)，但明顯有沙粒感2分粒流血流快，成直線(xiàn)，可區分細胞1分粒緩流血流緩慢，明顯區分細胞�？梢�(jiàn)細胞團試驗結果見(jiàn)表6。

表6  痛平膏對葡聚糖溶液致小鼠耳廓微循環(huán)障礙的影響  （x±s，n=10，μm）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

    3  討論
    
    炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應，其局部特征是紅、腫、熱、痛和功能障礙。為研究痛平膏的主要的作用，本實(shí)驗分別采用鎮痛、抗炎和微循環(huán)障礙的經(jīng)典動(dòng)物病理模型進(jìn)行觀(guān)察。實(shí)驗結果表明，痛平膏可提高動(dòng)物因熱刺激致痛的痛閾值，減少因醋酸刺激而發(fā)生扭體反應的動(dòng)物只數；對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹有抑制作用，可減輕二甲苯致小鼠耳腫脹的腫脹度；對靜脈注射葡聚糖溶液引起的小鼠微循環(huán)障礙，有明顯的改善作用。痛平膏對動(dòng)物炎癥、疼痛模型和微循環(huán)障礙模型均具有明顯的抗炎、鎮痛和活血作用，為臨床用于炎癥反應提供了實(shí)驗依據。
    
    痛平膏是外用制劑，其吸收方式和作用時(shí)間與常用的口服制劑有較大的區別，為獲得較完整的實(shí)驗數據，實(shí)驗中盡量測定其作用時(shí)間，以獲得時(shí)－效曲線(xiàn)，供臨床使用參考。

【參考文獻】

    1  陳奇.藥理實(shí)驗研究方.北京：人民衛生出版社，1993，360－361；377－378；502－503.
    2  徐叔云，卞如濂，陳修.藥理試驗方法學(xué)，第3版.北京： 人民衛生出版社，2002，911-913.

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