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公衛執業(yè)醫師考點(diǎn)：炭疽診斷標準及處理原則—附錄A
炭疽細菌學(xué)檢查
A1 標本的采取
A1.1 采取標本時(shí)必須遵循的兩條原則
A1.1.1 盡可能在抗生素治療開(kāi)始前采取標本。
A1.1.2 除必要時(shí)并在具備操作病毒細菌條件的實(shí)驗室內，不得用解剖的方式獲取標本。所需的血液與組織標本，均應以穿刺方式取得。
A1.2 血液標本
所有的疑似人類(lèi)病例和病畜，都應采取血液標本，標本量至少應滿(mǎn)足下列檢查的需要：
a)涂片進(jìn)行顯微鏡檢查;
b)接種培養基進(jìn)行細菌分離培養;
c)分離血清檢查抗體;
d)常規血液檢查。
A1.3 糞便與嘔吐物標本
表現消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無(wú)菌容器中。
A1.4 痰與咳碟標本
表現為呼吸道癥狀的可疑病人應收集其痰液標本，無(wú)痰液者，應取供細菌分離培養用的培養基，打開(kāi)平皿蓋置病人口鼻10cm處;令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。
A1.5 腦脊液標本
表現腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液，標本量參照A1.2的要求。
A1.6 尸體標本
食草動(dòng)物死于炭疽時(shí)，通常會(huì )從口、鼻、肛門(mén)等腔道開(kāi)口流出血液，這種血液應是首先采取的標本。如果血液已滲入土壤，則應收集混有血液的土壤作為標本。沒(méi)有血液流出，或已不可能獲取血液標本時(shí)，可通過(guò)穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實(shí)質(zhì)性臟器獲得組織標本。
A1.7 肉類(lèi)標本
如果懷疑罹患炭疽的家畜已被宰殺，或對商品肉類(lèi)進(jìn)行常規檢查時(shí)，可剪取小塊肉類(lèi)標本。如有可能，特別應剪取肝臟、脾臟等富含血液以及含淋巴組織的標本。
A1.8 毛皮或其他可疑污染物品標本
剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無(wú)菌試管內，加適量無(wú)菌生理鹽水浸泡。
A1.9 水標本
檢查水體污染時(shí)，用廣口瓶收集水樣。如須取深層水樣時(shí)，將帶蓋廣口瓶伸入水中，然后將用繩系住的瓶蓋提起。
A1.10 土壤標本
在牲畜死亡或宰殺的地點(diǎn)，應取土壤標本以供檢查。
A2 顯微鏡檢查
所有來(lái)自病人、病畜或尸體的標本，都應首先進(jìn)行顯微鏡檢查。
A2.1 復合負染法
將標本或懸液滴在載玻片上，立即加等量的炭素墨水，混勻推片。待干燥后滴加95%乙醇數滴，干燥后再以1%結晶紫液染1min，用水沖洗，干后用油鏡檢查。如果發(fā)現在細菌與炭素顆粒之間存在明顯的、連續的間隔帶，即說(shuō)明細菌的周?chē)嬖谇v膜。
液體標本(如血液、腦脊液)和懸液標本(如糞便或混有血液的土壤)在能夠采取標本后立即進(jìn)行顯微鏡檢查的情況下，推薦使用復合負染法。
A2.2 莢膜染色法
將標本涂片或印片干燥，妥善包裝后帶回實(shí)驗室，按常規方法固定，以美藍染液染色3～5min(如莢膜不清晰，染色時(shí)間可稍延長(cháng))，水洗、干后鏡檢。菌體呈藍色，而莢膜呈紅色。
組織印片標本，或制片后無(wú)法立即進(jìn)行顯微鏡檢查，或進(jìn)行大面積普查時(shí)，推薦使用莢膜染色法。
A2.3 顯微鏡檢查結果判定
來(lái)自病人、病畜或尸體的標本中如發(fā)現由較寬的莢膜環(huán)繞的、兩端平齊的粗大桿菌，特別是鏡下發(fā)現大量、純一通常呈竹節狀的該種細菌，而且沒(méi)有明顯的其他細菌污染時(shí)，炭疽的診斷便可確立。
A3 細菌分離培養
A1 中所列的全部標本，均應進(jìn)行細菌分離培養。
A3.1 培養基
炭疽芽孢桿菌的分離培養應同時(shí)用兩種培養基進(jìn)行：常規的血瓊脂平板和選擇性平板。后者按如下處方配制：
蛋白胨 2g EDTA 0.03g
氯化鈉 0.5g 乙酸亞鉈 0.004g
醇母浸膏粉 0.5g 水楊素 1g
0.2%溴麝香草酚藍(BTB) 1.2mL 瓊脂粉 1.8g
加蒸餾水至100mL，調pH至7.6，121℃滅菌20min，冷卻至45～50℃時(shí)，加入：多粘菌素B(3000u/mL水溶液)0.1mL，溶菌酶(30000u/mL水溶液)0.1mL，混勻后傾注平板。
A3.2 標本處理
在正常情況下應當無(wú)菌的標本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1mL，組織標本應先以無(wú)菌剪刀剪開(kāi)一斷面，在培養基表面壓印，然后以白金耳涂開(kāi)。
所有污染的和陳舊的標本，均應首先制成懸液。根據標本中含菌量的多少，可將懸液適當稀釋?zhuān)蚪?jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再3000r/min離心30min，取富集的沉淀物。將所得的懸液67℃加熱15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1mL。
A3.3 挑選可疑菌落
上述平板在37℃孵育過(guò)夜或24h后，檢查是否長(cháng)出可疑的炭疽芽孢桿菌菌落。
炭疽芽孢桿菌在血瓊脂平板上的形態(tài)為：灰白色、不透明、中等大小，常不規則，表面呈毛玻璃樣，周?chē)鸁o(wú)溶血環(huán)。
炭疽芽孢桿菌在選擇平板上菌落較血瓊脂平板上為小，具有類(lèi)似表面特征，菌落呈藍綠色。但是，若遇菌落形態(tài)與以上描述完全一致但呈黃色的菌落，也應進(jìn)行A4的鑒定步驟。
A4 炭疽芽孢桿菌鑒定
將上述可疑菌落挑出，劃線(xiàn)接種于普通營(yíng)養瓊脂平板之上，在劃線(xiàn)區內分別貼上浸有診斷用炭疽芽孢桿菌噬菌體和青霉素的紙片。37C孵育過(guò)夜或24h后，在兩種紙片的周?chē)霈F明顯的抑菌環(huán)，便可判定為炭疽芽孢桿菌。在病人、病畜或尸體中分離獲得炭疽芽孢桿菌，炭疽的診斷便可確立。
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