探討調節蛋白表達的影響

摘要： 目的 探討失血性休克大鼠TM、TM mRNA的變化機制及參附的干預作用的研究。 方法 SD大鼠分成：假休克組，休克組，林格液復蘇組，參附復蘇組。休克及復蘇2h 后，處死大鼠取出肝臟, Western blotting法測TM 變化，用RT－PCR法測TM mRNA的變化。結果 假休克組有 TM 、TM mRNA表達。休克組、林格液復蘇組TM 表達下降，TM mRNA表達上調，與假休克組比較有顯著(zhù)統計學(xué)意義。參附復蘇組TM 表達上調，TM mRNA 表達顯著(zhù)下調恢復，與假休克組比較無(wú)統計學(xué)意義，與休克組、林格液復蘇組比較有顯著(zhù)統計學(xué)意義。結論 失血性休克TM 蛋白表達下降，TM mRNA表達上調，與休克損傷有關(guān)。林格液對蛋白C激活系統表達無(wú)明顯調節作用。參附通過(guò)對內皮細胞的保護作用，具有抗休克作用。

關(guān)鍵詞： 失血性休克 凝血酶調節蛋白 參附注射液

　　創(chuàng )傷死亡的首要原因是失血性休克。2007年歐洲重癥監護醫學(xué)協(xié)會(huì )、歐洲休克協(xié)會(huì )等專(zhuān)家發(fā)表《控制大創(chuàng )傷后出血的治療指南》，指出大出血患者常由血管損傷及凝血功能異常所致。血管內皮細胞的主要功能為抗血栓形成,這也是維持血液流動(dòng)性的重要機制之一。PC系統發(fā)揮抗凝作用與血管內皮細胞上的凝血酶調節蛋白(thrombomodulin, TM) 、內皮細胞蛋白C 受體(endothelial protein C receptor, EPCR) 及血漿中的蛋白C(protein C,PC) 等有關(guān)。該系統是凝血酶生成后對凝血系統活化有負反饋作用的一個(gè)調節系統，不僅具有抗凝作用，而且在抗炎過(guò)程中發(fā)揮作用，當前重組人活化蛋白C對膿毒癥休克的治療已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展［１］。闡明PC系統在失血性休克的紊亂機制，對失血性休克的治療及預后具有重要意義。作者2008年1至5月通過(guò)研究建立失血性休克大鼠模型，用Western blotting法檢測肝臟內皮細胞TM 的表達水平，用RT-PCR法測TM mRNA的表達水平，觀(guān)察失血性休克抗凝系統變化機制及參附的干預作用。
1 材料與方法
1.1 一般資料 選用溫州醫學(xué)院動(dòng)物中心提供的Sprague Dawley(SD)大鼠40只，體重250～300ｇ。隨機分為4組：假休克組(A組)，失血性休克組(B組)，林格液復蘇組(C組)，參附復蘇組(D組)，每組10只。按Lamson［２］的方法，改良后復制失血性休克動(dòng)物模型。除A組外，其余大鼠均放血至40mmHg維持60 min，B組不復蘇，C組用3倍失血量的林格液復蘇；D組用含參附注射液 (10ml/kg)和林格液組成的3 倍失血量的液體復蘇。休克及復蘇2h 后，處死大鼠，立即取出其肝臟。
1.2 方法 （1）Western blotting法檢測大鼠肝臟組織勻漿TM 含量：制備蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE），轉膜，加TM小鼠單克隆IgG 抗體（Santa Cruz公司提供）與抗原結合，加辣根過(guò)氧化物酶標記的TM山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技術(shù)研究所提供）與一抗的結合，用聯(lián)苯胺顯色，Image master VDS成像系統攝影存盤(pán)后應用計算機圖像分析軟件(Quantity one 4.4.0)行灰度掃描分析。以目的基因與β-actin的條帶灰度之比作為反映相對指標。(2)RT－PCR法檢測大鼠肝臟組織勻漿TM mRNA含量：取肝組織約100mg, 以Trizol試劑盒一步法提取細胞總RNA , 采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT -PCR ) 技術(shù)對轉錄產(chǎn)物進(jìn)行擴增, 擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數為2% 的瓊脂糖凝膠電泳后照相。電泳結果采用計算機圖像分析系統(Gel-pro) 進(jìn)行掃描, 以灰度值表示電泳帶的強度。PCR所用引物采用Primer5.0計算機軟件設計，用BLAST驗證。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成提供。
1.3 統計學(xué)處理 　　數據以均值±標準差（x±s)表示，采用SPSS 12.0統計軟件包處理，多組間相同指標的比較采用單因素方差分析，如差異有統計學(xué)意義則進(jìn)一步行組內兩兩間比較，方差齊時(shí)采用LSD檢驗采用Student Newman Keuls法，方差不齊者采用Tamhane′s法。P＜0.05為差異有統計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著(zhù)統計學(xué)意義。
2 結果
　　A組大鼠肝組織有TM 、TM mRNA 表達。B組肝組織TM 表達下降， TM mRNA表達上調，與A組比較有顯著(zhù)統計學(xué)意義（P

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