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過(guò)量碘化物對原代培養的豬甲狀腺細胞凋亡的作用
作者：田英娟，田園，劉超，葉亮
【摘要】 目的 觀(guān)察過(guò)量碘化物對原代培養的豬甲狀腺細胞凋亡的誘導作用，并對機制作初步探討。方法 取健康的豬甲狀腺細胞培養24h后，加入不同濃度的碘化鉀(KI)，觀(guān)察細胞的形態(tài)改變；瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞術(shù)分析細胞DNA的降解；MDA法測定細胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。結果 加入KI 24h后，熒光染色鏡下觀(guān)察可見(jiàn)凋亡細胞；瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀帶；流式細胞術(shù)見(jiàn)亞二倍體（凋亡）峰，細胞凋亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物隨碘化物濃度的升高而升高(P<0.05)。結論 過(guò)量碘化物誘導了原代培養的豬甲狀腺細胞凋亡，可能通過(guò)活性氧機制啟動(dòng)凋亡。
【關(guān)鍵詞】 甲狀腺細胞凋亡；過(guò)量碘；活性氧
【Abstract】 Objective To study the effect of excess iodide on the primary cultured pig and its mechnism. Methods We employed the primary cultured pig thyroid cells. The apoptosis was evaluated by AQ-stained fluorescin， DNA ladder by gel electrophoresis and subdiploidy by propidium iodide-stained flow cytometry. The level of lipid peroxide under KI treatment was determined by measuring the production of thiobarbituric acid reactive substances.Results Thyroid cells treated with iodide excess at different concentration underwent apoptosis. Iodide displayed a dose-dependent apoptosis index and a dose-dependent generation of TBARS levels.Conclusion Iodide excess induce the apoptosis in the primary cultured pig thyroid cells. This type of apoptosis seems to be activated by reactive oxygen species.
【Key words】 thyroid cell apoptosis；iodide excess；reactive oxygen species
碘化物在人類(lèi)的日常生活中具有重要的意義。過(guò)量碘化物對甲狀腺及培養的甲狀腺細胞的毒性效應早已證實(shí)，近幾十年來(lái)從凋亡角度對這種作用作了一些研究［1～3］。目前過(guò)量碘化物對體外培養的豬甲狀腺細胞的作用未見(jiàn)報道，其誘導甲狀腺細胞凋亡的機制尚未闡明。本實(shí)驗觀(guān)察過(guò)量碘化物對原代培養的豬甲狀腺細胞凋亡的誘導作用，并對凋亡機制作初步研究。
1 與方法
1.1 主要試劑與儀器 F-12培養基為美國Gibco公司生產(chǎn)，促甲狀腺激素(TSH)、膠原酶為美國sigma公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡為日本Olympus BH-2型，流式細胞儀為美國B(niǎo)ecton Dickinson公司產(chǎn)品。
1.2 甲狀腺細胞培養 取適量的豬甲狀腺組織(錦州肉聯(lián)廠(chǎng)提供)PBS沖洗，剪碎倒入帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中，加入雙酶消化；每隔15～20min取出上2/3的消化液，漂洗制成細胞懸液；消化完畢將細胞懸液通過(guò)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，調整細胞數106/ml，接種于培養板上；置5%二氧化碳孵箱，在10%FCS、1u/LTSH的F-12培養基中培養，每2～3天更換培養基。
1.3 實(shí)驗分組 甲狀腺細胞正常培養24h后，加入處理因素并分組�？瞻讓φ战M：不加其他處理因素；陽(yáng)性對照組：放線(xiàn)菌酮（CHX）2×10-3g/L(終濃度)；陰性對照組：氯化鉀60mmol/L(終濃度)；實(shí)驗組：不同濃度的KI。所用濃度根據多次預實(shí)驗的結果并參考文獻資料［1］。
1.4 甲狀腺細胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 在倒置顯微鏡下，觀(guān)察各組培養細胞的形態(tài)及生長(cháng)狀況。培養24h后加入處理因素，再過(guò)24h收集細胞，經(jīng)吖啶橙（AO）染色在熒光顯微鏡下觀(guān)察。
1.5 瓊脂糖凝膠電泳 取實(shí)驗組（KI 1mmol/L，60mmol/L， 100mmol/L）、陰性對照組、陽(yáng)性對照組同時(shí)做電泳。加入處理因素再培養24h后收集細胞，分別加入細胞裂解液、RNA酶、樣品緩沖液混勻后，加樣于1%瓊脂糖凝膠的樣品孔，電泳結束觀(guān)察并記錄。
1.6 細胞凋亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化測定 實(shí)驗設6個(gè)不同的濃度組，加入KI再培養24h后收集細胞。用預冷的70%乙醇固定細胞，加入碘化丙啶（PI）染液后，流式細胞儀分析各組細胞DNA的含量分布；超聲震碎細胞，按南京建成生物公司提供的方法檢測MDA含量。亞二倍體峰（凋亡）細胞比率表示細胞的凋亡率。
1.7 學(xué)分析 實(shí)驗所得數據用均數±標準差表示，應用統計軟件SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析。
2 結果
2.1 甲狀腺細胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 甲狀腺細胞是腺體上皮細胞，20～24h貼壁生長(cháng)，細胞呈多邊形、圓形；２～3天可見(jiàn)典型的濾泡結構，5～6天細胞鋪滿(mǎn)單層。加入KI ６～8h濾泡結構開(kāi)始改變，細胞有分散傾向；24h后無(wú)典型濾泡結構，有的細胞變小、變圓，核內出現碎片；48h后可見(jiàn)漂浮的細胞，以后改變不明顯。
2.2 細胞凋亡的熒光顯微鏡觀(guān)察 陽(yáng)性對照組及實(shí)驗組的凋亡細胞核內可見(jiàn)致密濃染的黃綠色染色，呈圓形、月牙形，可見(jiàn)發(fā)泡現象及凋亡小體。陰性對照組細胞核內呈均勻的黃綠色染色。
2.3 瓊脂糖凝膠電泳 電泳結果顯示：陽(yáng)性對照組、KI組見(jiàn)明顯的凋亡條帶，呈云梯狀；高濃度的梯狀帶較明顯。陰性對照組無(wú)云梯狀帶(見(jiàn)圖1)。
2.4 細胞凋亡率測定 流式細胞儀分析表明在不同KI濃度組DNA直方圖上顯示：隨濃度的升高二倍體峰（G0/ G1期）細胞減少（P<0.05），亞二倍體峰（凋亡）細胞升高（P<0.05）。見(jiàn)表1。
2.5 脂質(zhì)過(guò)氧化程度測定 培養細胞加入過(guò)量的KI后，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的量隨濃度的升高而升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。
表1 在不同濃度KI作用下凋亡細胞（Ap）、G0／G1細胞所占比率 （%，±s）
注：不同濃度的KI組間比較，*P<0.05，△P＞0.05
表2 不同濃度碘化鉀作用下MDA含量 （nmol/mg，±s）
注： 不同濃度的碘化鉀組間比較，*P<0.05
2.6 相關(guān)性分析 從培養甲狀腺細胞的細胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA與細胞凋亡率的散點(diǎn)圖上可見(jiàn)，細胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平與細胞凋亡率呈顯著(zhù)正相關(guān)，r=0.993，P<0.01。
3 討論
自然界中與甲狀腺激素合成有關(guān)的碘主要是碘化鈉、碘化鉀。碘化物在人類(lèi)的日常生活中具有重要的意義，但過(guò)量碘化物對在體甲狀腺組織及培養的甲狀腺細胞都存在毒性效應［1～4］。本實(shí)驗豬甲狀腺細胞培養24h，加入過(guò)量碘化鉀，甲狀腺濾泡及細胞形態(tài)出現改變，細胞發(fā)生凋亡，反映了過(guò)量碘化物的細胞毒性效應。過(guò)量碘化物的這種毒性效應機制至今尚未闡明。
細胞壞死和凋亡是細胞兩種截然不同的死亡方式，但在某些情況下二者的區分較困難，尤其對培養細胞。當以細胞凋亡誘導劑進(jìn)行凋亡誘導時(shí)，開(kāi)始細胞以凋亡為特征，隨著(zhù)誘導時(shí)間的延長(cháng)或誘導劑濃度的增加，凋亡后期的細胞發(fā)生繼發(fā)性死亡的改變，稱(chēng)為細胞凋亡性壞死，即凋亡細胞出現腫脹、空泡化，甚至胞膜發(fā)生破裂［5］。過(guò)量碘化物引起培養甲狀腺細胞形態(tài)、超微結構、電位的改變，是細胞凋亡在不同階段的表現形式［1～4］。Vitale等研究過(guò)量碘化鉀對體外培養的甲狀腺TAD-2細胞系及人正常甲狀腺細胞的作用，認為在實(shí)驗中出現的甲狀腺細胞凋亡和壞死，是一個(gè)細胞凋亡的過(guò)程，壞死是細胞凋亡性壞死［1］。本實(shí)驗中過(guò)量碘化鉀誘導了原代培養的豬甲狀腺細胞凋亡；且細胞凋亡率隨濃度的升高而上升，呈劑量依賴(lài)關(guān)系，與Vitale的報道相符。
人們早已發(fā)現丙基硫氧嘧啶、甲硫咪唑、高氯酸等抑制過(guò)量碘化物對甲狀腺細胞的毒性作用，阻滯細胞的壞死和凋亡［1，4］。推斷碘離子的代謝過(guò)程可能與碘化物誘導的細胞凋亡有關(guān)。甲狀腺濾泡上皮細胞可濃縮I-，過(guò)氧化物酶在氧化I-過(guò)程中生成活性很高的自由基引起質(zhì)膜中脂質(zhì)過(guò)氧化，導致線(xiàn)粒體內活性氧的產(chǎn)生并釋放，誘導細胞凋亡。本實(shí)驗中MDA、細胞凋亡率均隨碘化物濃度的升高而升高，推測加入過(guò)量碘化鉀后，質(zhì)膜中脂質(zhì)過(guò)氧化導致活性氧的釋放，誘導培養的甲狀腺細胞凋亡，其途徑可能通過(guò)活性氧機制。過(guò)量碘化物誘導的甲狀腺細胞凋亡的過(guò)程中，檢測到的細胞色素C、活性 氧、Caspase酶、Bcl家族蛋白提示了線(xiàn)粒體在這種細胞凋亡中可能起重要的作用［1，2，6］。
從左到右陰性對照組、陽(yáng)性對照組、實(shí)驗組(KI1、60、100mmol/L)?
圖1 對照組、陽(yáng)性組及實(shí)驗組瓊脂糖凝膠電泳結果
【參考文獻】
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