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羊松果體細胞原代培養及其生物學(xué)特性的研究
松果體為哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)內分泌器官，產(chǎn)生多種胺類(lèi)和肽類(lèi)物質(zhì)，下面是小編搜集整理的一篇探究羊松果體細胞原代生物特性的論文范文，歡迎閱讀查看。
摘要：體外培養山羊及綿羊的松果體細胞，觀(guān)察其增殖情況和功能狀態(tài)的變化。結果顯示：山羊、綿羊的松果體細胞體外形態(tài)及生長(cháng)情況相似。細胞多呈圓形或多角形，細胞體積有增大趨勢。采用MTT了法檢測細胞生長(cháng)狀態(tài)，發(fā)現細胞有明顯的增殖現象，大約于11d達到高峰，用免疫組織化學(xué)對培養細胞進(jìn)行染色，發(fā)現5-HT陽(yáng)性細胞數量隨細胞的增殖而增加。表明山羊和綿羊松果體細胞在體外均增殖旺盛，并能保持體內的分泌功能。
關(guān)鍵詞：松果體細胞培養;M9了;5-HT免疫組化
松果體為哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)內分泌器官，產(chǎn)生多種胺類(lèi)和肽類(lèi)物質(zhì)，其主要分泌物--褪黑素(MT)對許多器官的功能具有重要的調節作用。為了解松果體的生理價(jià)值，許多學(xué)者采用體外培養技術(shù)研究其細胞形態(tài)和分泌功能.體外構建松果體組織并植入動(dòng)物體內成為目前研究的熱點(diǎn)，這些研究有助于深入了解松果體的活動(dòng)特點(diǎn)，為進(jìn)一步調節動(dòng)物體內松果體細胞分泌的研究積累材料。
哺乳動(dòng)物松果體細胞培養早在20世紀70年代國外就有報道，1977年Rowe首次觀(guān)察了體外培養大鼠松果體細胞的形態(tài)，1978年Budat成功檢測了培養的大鼠松果體細胞褪黑素合成和分泌功能。本實(shí)驗以山羊和綿羊作為研究對象，對其松果體進(jìn)行體外培養，觀(guān)察在無(wú)其他因素干擾條件下山羊和綿羊松果體細胞的形態(tài)變化、增殖過(guò)程和功能狀態(tài)的異同，為研究松果體細胞分泌特點(diǎn)及改變動(dòng)物繁殖現狀提供依據。
l材料與方法
1.1主要實(shí)驗試劑及儀器
DMEM培養液(GIBCO，美國)，M199培養液(sigma，美國)，犢牛血清(sigma，美國)，胰蛋白酶(sigma，美國)，雙抗(武漢亞法)，MTr(sigma，美國)，DMSO(國產(chǎn)分析純)，兔抗5-HT血清(武漢博士德)，SABC試劑盒(武漢博士德)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，自動(dòng)酶標儀(Tecan，澳大利亞)，C02培養箱(LAB―LINE，美國)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)。
1.2松果體細胞的體外培養
按伊斯蘭方法屠宰1歲齡健康萊蕪黑山羊6只、小尾寒羊5只，分別進(jìn)行以下步驟：迅速開(kāi)顱取出松果體，冷D-hank昌液沖洗;剪碎后，0.25%膠原酶消化30min，含血清培養液中和，反復吹打，離心;加完全培養液吹打混勻，按每mL1xl04的細胞密度分別接種于96孔培養板(分7組，每組6孔)和24孔板(分7組，每組3孔，每孔內置一蓋玻片)，放人37℃、5%C02培養箱內培養。另外，本
實(shí)驗中山羊采用DMEM培養液，綿羊采用M199培養液。
1.3MTT法檢測細胞增殖
從培養第3d開(kāi)始，隔日取96孔板內一組細胞，每孔加入MTY15μL，繼續培養4h后，每孔加入DMSO30gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。處測吸光度值并繪制曲線(xiàn)。
1.45-HT免疫組織化學(xué)方法24孔板每組從第3d開(kāi)始隔日取出細胞爬片，PBS沖洗，冷95%乙醇固定10min;用正常羊血清在室溫下封閉30rain;加入兔抗5―HT血清(1：100)37℃孵育2h，然后4℃過(guò)夜，PBS沖洗3rainx3;加入生物素標記的IgG，37℃30min，PBS沖洗3minx3;SABC復合物37℃下作用30rain，PBS洗3minx3;DAB鏡下顯色5～10Min;蘇木素復染，脫水，透明，封片觀(guān)察。
2結果
2.1松果體細胞的形態(tài)觀(guān)察
倒置顯微鏡觀(guān)察體外培養的山羊、綿羊松果體細胞形態(tài)相似，大多呈圓形或多角形，x400下觀(guān)察呈圓圈狀。培養過(guò)程中都可見(jiàn)到“8”形的細胞形態(tài)，可能為正處于細胞分裂期。培養后期，細胞體積略增大，折光性減弱，但形態(tài)變化不大。另外可見(jiàn)具有長(cháng)突起的小膠質(zhì)細胞(圖1、2)。
2.2MTT檢測結果
從表1和圖3可以看出，體外培養的松果體細胞數量前7d增長(cháng)緩慢，第9d開(kāi)始分裂增殖速度加快，于第11d左右達到高峰，此后生長(cháng)曲線(xiàn)開(kāi)始緩慢下降。
2.3.5-HT免疫組化染色結果
不同培養時(shí)期都可見(jiàn)細胞爬片上布滿(mǎn)棕黃色的5-HT陽(yáng)性細胞，培養后期細胞的陽(yáng)性反應仍然明顯，松果體細胞多呈圓形或多角形，高倍鏡下細胞中陽(yáng)性物質(zhì)呈不均質(zhì)分布，細胞輪廓無(wú)明顯界限，復染后核位于細胞中間，呈規則的圓形(圖4、5)。培養前期隨時(shí)間延長(cháng)，陽(yáng)性細胞數有增加現象;在11d細胞增殖達高峰后，陽(yáng)性細胞數量變化不大。
3討論
1)體外條件下培養山羊、綿羊的松果體細胞形態(tài)相似，初期呈小圓形、折光性強，后期細胞逐漸增大、折光性減弱，這與廖華對大鼠松果體細胞的報道基本一致。
2)MTT比色法是一種檢測細胞增殖情況的經(jīng)典方法，酶標儀所測的OD值可反映出細胞的相對數量。從測量OD值得出的生長(cháng)曲線(xiàn)可見(jiàn)，兩種羊雖在不同培養液中生長(cháng)，但其增殖趨勢相同，松果體細胞在培養第9d開(kāi)始增殖，11d左右達到高峰，隨后增長(cháng)緩慢。證明松果體細胞在常規培養條件下，能保持其增殖能力，細胞數目明顯增加，而在成年動(dòng)物體內，松果體細胞與神經(jīng)元一樣，數目恒定且很難再生。對于一特定動(dòng)物來(lái)說(shuō)，隨著(zhù)年齡的增長(cháng)松果體細胞開(kāi)始退化，同時(shí)也沒(méi)有新生的細胞出現，因此松果體這一器官將逐漸衰老而無(wú)法發(fā)揮其功能。本實(shí)驗發(fā)現體外松果體細胞表現出明顯的增殖現象，說(shuō)明體外構建松果體組織用于解決細胞的更新問(wèn)題渴望成為可能。
3)褪黑素是松果體細胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多種酶的作用下轉化而成，因此檢測轉化過(guò)程中的任一中間產(chǎn)物或酶都可反映細胞的功能狀態(tài)，本實(shí)驗采用目前常用的5―羥色胺免疫細胞化學(xué)染色，因為5-羥色胺作為MT的前體與MT的分泌有著(zhù)密切的關(guān)系，可初步判斷松果體細胞的功能狀態(tài)。我們對培養不同時(shí)期的細胞爬片進(jìn)行抗5―羥色胺免疫細胞化學(xué)染色，發(fā)現爬片上布滿(mǎn)陽(yáng)性細胞，細胞中含有大量呈點(diǎn)狀的陽(yáng)性顆粒，細胞多為圓形和不規則形，陽(yáng)性細胞數量隨細胞總數的增加而增加。證明體外增殖的松果體細胞具有合成5-HT，分泌MT的能力。
4)本研究所選的實(shí)驗動(dòng)物山羊、綿羊均為季節性繁殖動(dòng)物，光周期是影響其生殖活動(dòng)的主要環(huán)境因素。松果體分泌的褪黑素在光周期感受過(guò)程中處于調控的中心地位，褪黑素主要通過(guò)與下丘腦-垂體―性腺軸的相互作用達到動(dòng)物生殖周期與環(huán)境光周期的同步變化。實(shí)驗證明體外構建的松果體組織具有旺盛的增殖和分泌能力，因此可以考慮給動(dòng)物植入新的松果體，并人為控制細胞的分泌狀態(tài)，延長(cháng)動(dòng)物的繁殖季節，以達到增加繁殖率的目的。同樣其它季節性繁殖動(dòng)物如藏羚羊等瀕臨滅絕物種也可采用該方法來(lái)提高種群數目。通過(guò)本課題的研究，我們可以為人工繁殖稀有動(dòng)物提供一個(gè)新的思路。
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