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蒲公英多糖體外抑瘤和抗突變作用研究
蒲公英是中醫臨床常用的一種中草藥，下面是小編搜集整理的一篇關(guān)于蒲公英多糖體外抑瘤作用研究的論文范文，供閱讀參考。
【摘要】目的觀(guān)察蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制和抗突變作用。方法采用MTT法測定蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制作用，用微核實(shí)驗檢測抗突變作用。結果蒲公英多糖隨濃度的增加對肝癌細胞的抑制率增加，但不明顯;可以顯著(zhù)提高外周血細胞免疫力，拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變(P<0.01)。結論蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制作用不明顯;能有效地拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變。
【關(guān)鍵詞】 蒲公英多糖 抑瘤 微核突變
蒲公英Taraxacum L.是中醫臨床常用的中草藥,具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋、健胃消炎、保肝利膽等功效[1]。研究發(fā)現，蒲公英有抗菌[2]、抗突變[3]、抑瘤[4]、抗氧化[5]等多種藥理作用，并能提高機體免疫性，對抗環(huán)磷酰胺引發(fā)的DNA損傷[6]。蒲公英根部富含多糖[7]，研究發(fā)現多糖具有廣泛的藥理作用，其中多糖誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖是目前研究的熱點(diǎn);同時(shí)外界環(huán)境誘發(fā)的突變是腫瘤細胞形成的重要因素之一。本文就蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制以及對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的突變的拮抗作用進(jìn)行了研究。
1、材料與儀器
1.1 試劑PMI1640，美國GIBCO產(chǎn)品;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品;環(huán)磷酰胺(CP)，上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品;噻唑蘭(MTT)，Sigma公司產(chǎn)品;植物血凝素(PHA)，金爾康動(dòng)物藥業(yè)有限公司;DMSO，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Giemsa， Sigma公司產(chǎn)品。
1.2 材料東北蒲公英T.ohwianum Kitag.采自黑龍江省五大連池自然風(fēng)景區。蒲公英多糖的制備參照文獻[8]法進(jìn)行。肝癌細胞Bel-7402和正常人外周血淋巴細胞均由齊齊哈爾醫學(xué)院饋贈。
1.3 儀器KHB全自動(dòng)酶標儀(ST-360)，北京桑翌實(shí)驗儀器研究所產(chǎn)品;細胞培養箱，河北省虹宇儀器設備有限公司產(chǎn)品;96孔板，Greiner公司產(chǎn)品;超凈工作臺，ESCO公司產(chǎn)品。
2、方法
2.1 MTT法[9]檢測蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7402的抑制作用運用改良的MTT實(shí)驗[9]計算蒲公英多糖對腫瘤的抑制作用，蒲公英多糖的終濃度為25，50，100，200，400，800，1 600，3 200 μg/ml。陽(yáng)性對照加CP，終濃度為260 μg/ml;每個(gè)濃度均設6個(gè)平行孔。酶標儀的吸收波長(cháng)采用570nm。
抑制率(IR)=(空白對照組OD值-多糖組OD值)/空白對照組OD值。采用SPSS數據包進(jìn)行方差分析。
2.2 微核實(shí)驗檢測蒲公英多糖拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變常規采人外周血與培養[10]。細胞培養24 h后，將蒲公英多糖用PBS溶液配成溶液，微孔濾膜過(guò)濾(0.2 μm)。將多糖溶液加到培養瓶?jì)�，使多糖濃度分別為50，200，800，3 200 μg/ml。繼續培養24 h后，向每瓶?jì)燃尤?5 ml CP，使CP濃度達到100 μg/ml。另設空白對照組和CP陽(yáng)性對照組，空白對照組加PBS不加CP，CP陽(yáng)性對照組加CP不加多糖。制片采用文獻[10]法進(jìn)行。
統計：觀(guān)察計數1 000個(gè)可計數轉化細胞的微核(MN)數，計算千分率(MN‰)。用SPSS軟件包分析各組數據。抑制率(%)=(陽(yáng)性組MN數-實(shí)驗組MN數)×100/陽(yáng)性組MN數。
3、結果
3.1 蒲公英多糖體外抑瘤作用蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7402的細胞毒作用見(jiàn)表1。結果顯示，隨著(zhù)蒲公英多糖濃度的增大，對腫瘤細胞的抑制作用也在增大，即蒲公英多糖對腫瘤細胞的抑制作用存在量依賴(lài)關(guān)系。但是即使在很大的濃度下(3 200 μg/ml)，多糖對腫瘤細胞的抑制率僅為27.94%，而此時(shí)蒲公英多糖溶液中已出現很少量的不溶解的多糖，因此，多糖的實(shí)際濃度未能達到實(shí)驗設計的水平。而CP在較低濃度(260 μg/ml)下對腫瘤細胞的抑制作用就已經(jīng)很顯著(zhù)了(IR>30%)。一般認為，只有當抑制率達到30%以上才說(shuō)明腫瘤細胞對藥物敏感[11]，蒲公英多糖對腫瘤細胞的最大抑制率小于30%，故認為蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7402沒(méi)有明顯的抑制作用。表1 蒲公英多糖對Bel-7407的抑制作用(略)
3.2 蒲公英多糖拮抗CP誘發(fā)的微核突變CP是一種烷化劑，是臨床常用的免疫抑制劑，能夠抑制細胞的增殖，常做抗癌藥物;同時(shí)它對正常細胞DNA的合成及分裂具有強烈的抑制作用，從而明顯誘發(fā)微核產(chǎn)生。由表2可知，陽(yáng)性對照組(CP組)與空白對照組的微核率相差極為顯著(zhù)(P<0.01)。蒲公英多糖對CP誘發(fā)的微核突變有明顯的抑制作用，細胞微核率與CP對照組相比差異極顯著(zhù)(P<0.01)，并且實(shí)驗各組的抑制作用呈劑量效應。由此可見(jiàn)，蒲公英多糖對CP誘發(fā)的外周血淋巴細胞微核突變有很顯著(zhù)的拮抗作用，說(shuō)明蒲公英多糖對遺傳物質(zhì)具有保護作用，即抗突變作用。表2 蒲公英多糖對CP誘發(fā)微核的拮抗作用(略)
4、討論
本實(shí)驗表明，蒲公英多糖對腫瘤細胞的抑制作用存在著(zhù)劑量效應，但是抑制作用不明顯。抑制作用不明顯可能是由于以下幾種原因：①應用體外細胞培養進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選有周期短、結果顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著(zhù)一定的局限性，主要表現在：假陰性結果導致有效藥物的漏篩。有些藥物如生物反應調節劑需要通過(guò)機體的反應才能對細胞起作用，有些藥物必須經(jīng)過(guò)體內酶的代謝活化才能變成活性成分，此類(lèi)藥物在進(jìn)行體外篩選時(shí)就會(huì )產(chǎn)生假陰性結果，從而導致有效藥物的漏選，因此，體外試驗的結果必須通過(guò)體內試驗進(jìn)一步驗證。②本實(shí)驗所用蒲公英多糖為熱水浸提法獲得，提取過(guò)程中采用80℃，這個(gè)溫度會(huì )不會(huì )破壞多糖的生物活性尚未可知;并且所用的多糖為精制粗多糖，沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化，其中的微量蛋白質(zhì)等成分可能對細胞的增殖有影響;或者不同分子量的多糖對腫瘤的作用也不相同，它們的相互作用使得蒲公英多糖的抑瘤效果不顯著(zhù)。③蒲公英多糖的抑瘤作用有可能是通過(guò)提高機體免疫功能而發(fā)揮作用。
蒲公英多糖可以有效拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變，保護DNA不受損傷。雖然蒲公英多糖對腫瘤細胞沒(méi)有直接抑制作用，但是也說(shuō)明了蒲公英多糖對細胞沒(méi)有毒害作用，不會(huì )對正常細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，在臨床上不會(huì )由于使用蒲公英多糖而帶來(lái)對機體的副作用�？梢栽O想，在臨床上將蒲公英多糖與抑瘤藥物配合使用，既增強了藥物的抑瘤作用，又可以有效保護正常細胞不受損傷，這將在進(jìn)一步的實(shí)驗研究中進(jìn)行探索。
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