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微生物檢驗之生化實(shí)驗大全
不同的細菌具有各自的獨特的酶系統，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生物化學(xué)特性，可利用生物化學(xué)的方法測定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細菌。掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎。生理生化特性的測定主要根據Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關(guān)試驗。下面是yjbys小編為大家帶來(lái)的微生物鑒定之生化實(shí)驗大全的知識，歡迎閱讀。
碳水化合物代謝實(shí)驗
糖(醇、苷)類(lèi)發(fā)酵實(shí)驗
(1)原理：
細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關(guān)，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類(lèi)后的終產(chǎn)物亦不一致，在含糖培養基中加入指示劑，若細菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物
(2)基本培養基：
在培養基中加入0.5%～1%的糖類(lèi)(單糖、雙糖、或者多糖)、醇類(lèi)(甘露醇、肌醇)苷類(lèi)(水楊苷、菊糖等)。培養基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類(lèi)型。
(3)實(shí)驗方法：
取某一種細菌的24h純培養物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養基內，37℃培養24h，觀(guān)察結果并記錄。
(4)結果判定：
如果接種進(jìn)去的細菌可發(fā)酵某種糖或醇，則可產(chǎn)酸，使培養基由紫色變成黃色，如果不發(fā)酵，則仍保持紫色。如，發(fā)酵的同時(shí)又產(chǎn)生氣體，則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。
(5)應用：
是鑒定細菌最主要最基本的實(shí)驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。
氧化型與發(fā)酵型(O/F)的測定
(1)原理：
細菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必需有氧的'參加的，稱(chēng)為氧化型，細菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，可以進(jìn)行無(wú)氧降解的，稱(chēng)為發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌無(wú)論在有氧或者無(wú)氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱(chēng)為產(chǎn)堿型。這在區別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。
(2)培養基：
培養基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1%溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解;分裝試管，3～4mL/管;115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出后冷卻成瓊脂柱。
(3)實(shí)驗方法：
挑取18～24h的幼齡斜面培養物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，于其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養24小時(shí)或更長(cháng)時(shí)間。
(4)結果判定。
Β-半乳糖苷(ONPG)實(shí)驗
(1)原理：
有的細菌可以產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷，而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下也可以檢測出。
(2)培養基：
鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol/L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過(guò)濾除菌，在無(wú)菌條件下與1%蛋白胨水混合，分裝試管，每管2～3mL，無(wú)菌檢驗后備用。
(3)實(shí)驗方法：
取一環(huán)細菌純培養物接種在ONPG培養基上置37℃培養1～3h或24h，如有β-半乳糖苷酶，會(huì )在3h內產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚;如無(wú)此酶，則在24h內不變色。
七葉苷水解實(shí)驗
(1)原理：
有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養基呈黑色。
(2)應用：
主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽(yáng)性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。
甲基紅實(shí)驗
(1)原理：
細菌分解培養基中的葡萄糖產(chǎn)酸，當產(chǎn)酸量大，使培養基的pH降至4.5以下時(shí)，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗陽(yáng)性。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉化為其它物質(zhì)(如，醇、酮、醛、氣體和水等)則培養基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。
(2)實(shí)驗方法：
一種細菌的24h培養物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中，置37℃培養48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養液呈紅色者為陽(yáng)性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。
(3)應用：
主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽(yáng)性后者為陰性。
V-P實(shí)驗
(1)原理：
有些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養基內蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應生成紅色的化合物。若培養基中的胍基含量過(guò)少，則可加入少量含胍基的化合物等。
(2)V-P試劑：
肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。
(3)實(shí)驗方法：
接種實(shí)驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養基(與甲基紅實(shí)驗相同)中，每次兩個(gè)重復，置適溫培養2-6d，取培養液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養液出現紅色，即為實(shí)驗陽(yáng)性反應，有時(shí)需要放置更長(cháng)時(shí)間才出現紅色反應。
(4)應用：
本實(shí)驗常與甲基紅實(shí)驗一起用，因為前者陽(yáng)性的細菌，后者通常為陰性。
蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實(shí)驗
明膠液化實(shí)驗
(1)原理：
某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養基成為流動(dòng)的液體。
(2)實(shí)驗方法：
取18～24h的斜面培養物穿刺接種，并有兩支未接種的空白對照。
(3)結果觀(guān)察：
于30℃培養20天后觀(guān)察，明膠液化的.為陽(yáng)性。由于室溫下明膠培養基呈液狀，因此在觀(guān)察結果時(shí)，應將其放置于4℃的冰箱中30分鐘后拿出觀(guān)察。若明膠仍能全部凝固，為陰性，有部分或全部不能凝固為陽(yáng)性。
吲哚實(shí)驗
(1)原理：
某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當加入吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。
(2)培養基：
蛋白胨水培養基。
(3)實(shí)驗方法：
將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養基中，35℃孵育24~48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀(guān)察結果。
(4)結果：
于兩液面接觸處出現紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。
(5)應用：
主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。
硫化氫試驗
(1)原理：
某些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀)。
(2)實(shí)驗方法：
將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養基中，于35℃孵育24h -48h，觀(guān)察有無(wú)黑色沉淀出現。
(3)結果：
培養基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/p>
(4)應用：
主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門(mén)菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛(ài)德華菌屬等為陽(yáng)性，其它菌屬大多為陰性。但沙門(mén)菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門(mén)菌等。
尿素分解試驗
(1)原理：
某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養基呈堿性。
(2)培養基：
尿素培養基。
(3)實(shí)驗方法：
將待檢菌接種于尿素培養基，于35℃孵育18~24h小時(shí)觀(guān)察結果。
(4)結果：
培養基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/p>
(5)應用：
主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽(yáng)性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽(yáng)性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。
苯丙氨酸脫氨酶試驗
(1)原理：
測定細菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應。
(2)培養基：
苯丙氨酸瓊脂培養基。
(3)實(shí)驗方法：
將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養基中，35℃孵育18~24h，滴加10% 三氯化鐵試劑3~4滴，自斜面上方流下。
(4)結果：
有綠色出現為陽(yáng)性。應立即觀(guān)察結果，延長(cháng)反應時(shí)間會(huì )引起退色。
(5)應用：
主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽(yáng)性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。
氨基酸脫羧酶試驗
(1)原理：
某些細菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來(lái)。
(2)培養基：
氨基酸脫羧酶培養基和氨基酸對照培養基。
(3)實(shí)驗方法：
將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴(lài)氨酸，鳥(niǎo)氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗管1支氨基酸脫羧酶對照管(無(wú)氨基酸)，各覆蓋至少12.5px高度的無(wú)菌石蠟油，35℃孵育1~4d，每日觀(guān)察結果。
(4)結果：
對照管應為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測定管呈紫色則為陽(yáng)性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現紫色則試驗無(wú)意義，不能做出判斷。
(5)應用：
主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。如，沙門(mén)菌屬中除傷寒和雞沙門(mén)菌外，其余沙門(mén)菌的賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性。志賀菌屬除宋內和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。
碳源和氮源的利用實(shí)驗
唯一碳源利用實(shí)驗
(1)原理：
在基礎培養基只提供一種待檢測碳源，若菌株生長(cháng)則表明菌株能以此種碳源為唯一碳源，否則不能。
(2)培養基：
基本培養基：
(NH4)2HPO41g;NaCl 1g;MgSO47H2O 0.2 g;KH2PO40.5 g;瓊脂20g;蒸餾水1000mL;pH7.0-7.2。
各種碳源的終濃度如下：
糖類(lèi)及其衍生物(醇類(lèi)，糖苷類(lèi)等)：1%，w/v;多醇和甘油：1%，w/v;苯甲酸鹽，二酸鹽，其它單酸鹽：0.1%，w/v。糖類(lèi)及其衍生物和多醇要求過(guò)濾除菌，鹽類(lèi)可加入培養基一起滅菌。
(3)實(shí)驗方法：
將純的'菌株接種到培養基后培養14~28d，觀(guān)察其生長(cháng)情況，以不加碳源的培養基作對照。能夠生長(cháng)為陽(yáng)性。
唯一氮源利用實(shí)驗
(1)原理：
在基礎培養基只提供一種待檢測氮源，若菌株生長(cháng)則表明菌株能以此種氮源為唯一碳源，否則不能
(2)培養基：
基礎培養基：
D-Glucose1g;MgSO47H2O0.05 g;NaCl 0.05 g;FeSO47H2O 0.001 g;KH2PO4 0.01 g。不同氮源按0.5%的濃度加入。
(3)實(shí)驗方法：
將純的菌株接種到培養基后培養14~28d，觀(guān)察其生長(cháng)情況，以不加氮源的培養基作對照。能夠生長(cháng)為陽(yáng)性。
各種酶類(lèi)實(shí)驗
氧化酶試驗
(1)原理：
氧化酶(即細胞色素氧化酶)，是細胞色素氧化酶系統中的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，生成有色的醌類(lèi)化合物。因此，本試驗結果與細胞色素C的存在有關(guān)。
(2)實(shí)驗方法：
菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上;濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，蘸取菌少許，然后加試劑;試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。
(3)結果：
細菌在與試劑接觸10秒內呈深紫色，為陽(yáng)性。無(wú)色為陰性。為保證結果的.準確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽(yáng)性和陰性對照。
(4)應用：
主要用于腸桿菌科細菌和假單胞菌屬的鑒別，前者陰性，而后者陽(yáng)性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽(yáng)性反應。
過(guò)氧化氫酶試驗(觸酶試驗)
(1)原理：
具有過(guò)氧化氫酶的細菌，能催化過(guò)氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現氣泡。
(2)實(shí)驗方法：
取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細菌，加3%過(guò)氧化氫數滴，立即觀(guān)察結果。
(3)結果：
若立即出現大量氣泡為陽(yáng)性。無(wú)氣泡為陰性。
(4)應用：
革蘭陽(yáng)性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗常用于革蘭陽(yáng)性球菌的初步分群。
硝酸鹽還原實(shí)驗
(1)原理：
硝酸鹽還原反應包括兩個(gè)過(guò)程：一是在合成代謝過(guò)程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉化為氨基酸和細胞內其它含氮化合物;二是在分解代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統中的終末受氫體。硝酸鹽還原過(guò)程可因細菌不同而異。有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等;有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨;有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌;有的細菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。
(2)實(shí)驗方法：
將待檢菌接種于硝酸鹽培養基(內含小倒管)中，35℃孵育1~4d。將甲、乙等量混合液(用時(shí)混合)(約0.1ml)加于試管內，立即觀(guān)察結果。
(3)結果：
出現紅色為陽(yáng)性反應。若加入試劑后無(wú)顏色反應，可能是：
�、傧跛猁}沒(méi)有被還原，試驗陰性;
�、谙跛猁}被還原為氨和氮等其他物質(zhì)而導致假陰性結果，這時(shí)應在試管內加入少許鋅粉，如出現紅色則表明試驗確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明試驗為假陰性。
若要觀(guān)察是否有氮氣產(chǎn)生，可于培養基管內加1只小導管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮氣生成。
(4)應用：
本試驗廣泛用于細菌鑒定。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產(chǎn)生氮氣;有些厭氧菌如韋榮菌等試驗也為陽(yáng)性。
淀粉酶實(shí)驗
(1)原理：
有些細菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不在變藍。
(2)培養基：
淀粉瓊脂培養基。
(3)實(shí)驗方法：
在淀粉培養基上接種實(shí)驗菌株后，30℃培養1～2周后將平板取出，滴加少量盧戈氏碘液于平板上。觀(guān)察菌苔周?chē)呐囵B基有無(wú)色透明圈出現。
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