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細胞培養中的微生物污染及防控對策的論文
細胞培養污染是指培養環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。體外細胞污染可分為3類(lèi)： 物理性、化學(xué)性、生物性污染[1].其中生物性污染常見(jiàn)且造成的后果也較為嚴重，培養的細胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉性，輕則污染細胞廢棄，重則連帶污染培養箱內的其他細胞，甚至整個(gè)實(shí)驗室的環(huán)境，給科研工作帶來(lái)嚴重的損失和威脅。以下對細胞培養過(guò)程中常見(jiàn)的微生物污染及防控作以介紹。
1 細菌污染
細菌污染特點(diǎn)為污染速度快，易被發(fā)現。細菌污染后，培養基1 ~ 2 d就會(huì )變渾濁，對細胞生長(cháng)影響明顯[2],p H值改變[3].常見(jiàn)細菌種類(lèi)為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等（ 革蘭陰性菌） 葡萄球菌等（ 革蘭陽(yáng)性菌）[4-5],其中革蘭陽(yáng)性菌較為多見(jiàn)[6],利用此特點(diǎn)可指導抗生素的應用。污染主要來(lái)源實(shí)驗室環(huán)境、實(shí)驗人員（ 實(shí)驗服）、實(shí)驗用具等[4].污染后的鏡下特點(diǎn)為： 胞漿出現大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，污染較輕時(shí)可見(jiàn)小菌體在細胞間運動(dòng)[5].
疑細菌污染后，可取少量培養液涂片染色檢查以證實(shí)細菌種類(lèi)； 有的培養液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物 的 培 養 液 接 種，也 可 取10 m L細 胞 懸 液 以100 rpm離心5 min,沉淀中加入無(wú)抗生素的培養液2 m L,置于37 ℃培養，24 h可得結果。確定污染后，若想進(jìn)行挽救可在細菌污染培養液中添加雙抗（ 青鏈霉素）、西司他丁鈉+亞胺培南消除細菌污染[4,7].
2 霉菌污染
霉菌污染特點(diǎn)為短期內不會(huì )引起培養液的渾濁，可在培養液中形成白色或黃色漂浮物。污染的主要來(lái)源為實(shí)驗人員（ 實(shí)驗服）[5].污染后的鏡下特點(diǎn)為： 低倍鏡下可見(jiàn)乳白色的團狀漂浮物，培養液無(wú)變化； 高倍鏡下可見(jiàn)明顯的菌絲，細胞活力變差，生長(cháng)速度明顯變慢，甚至死亡[8].
疑有霉菌污染的細胞可離心后經(jīng)PAS染色進(jìn)行霉菌鏡檢，同時(shí)進(jìn)行霉菌培養以確定污染及鑒定霉菌種類(lèi)[9].霉菌污染初期，在培養液中可見(jiàn)漂浮的菌絲，這時(shí)將污染的細胞培養液慢慢吸出，用Hanks液清洗細胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培養液，即青霉素100單位/m L,鏈霉素100單位/m L,兩性霉素10 mg /L,24 h后觀(guān)察換液，若仍有菌絲可重復上述步驟進(jìn)行處理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但經(jīng)此種方式處理后對細胞的生長(cháng)影響也較大。另有報道低速離心法可清除霉菌污染，方式簡(jiǎn)單對細胞影響小[9].但建議一般出現霉菌污染，如果不是非常珍貴的細胞一般都是扔掉，而且連相關(guān)的容器都要做嚴格的處理。
3 支原體污染
支原體污染的特點(diǎn)為短期無(wú)變化，具有隱蔽性。它們可以與細胞長(cháng)期共存，培養基一般不發(fā)生渾濁，細胞無(wú)明顯變化，外觀(guān)上給人以正常的感覺(jué)。如果繼續使用這種已被支原體污染而貌似正常的細胞做試驗或生產(chǎn)，將會(huì )嚴重影響結果[1].污染的主要來(lái)源為血清[4].污染后鏡下特點(diǎn)： 在光鏡下�？梢�(jiàn)到細胞核及胞漿內出現大小不等的顆�；蚩张輀10].
目前實(shí)驗室檢查支原體污染的金標準為DNA熒光染色法結合直接培養法[11],主要輔助檢測方法有PCR法、顯 微鏡法等[12-16],其他方法有滾環(huán)擴增技術(shù)[17]、瓜氨酸測定法[18]、免疫熒光抗體法、放射自顯影法[19]等。相對于其他污染的檢測，支原體污染的檢測方法雖多，但在價(jià)格及特異性方面差異很大，應根據實(shí)驗需要及實(shí)驗條件進(jìn)行選擇。支原體的清除一般不宜用抗生素，因其對抗生素不敏感，主要的清除方法有抗血清處理法、高溫處理法、小鼠腹腔巨噬細胞清除法、選擇性殺滅哺乳動(dòng)物類(lèi)細胞培養物中支原體的方法，其中小鼠腹腔巨噬細胞清除法效果較好，方法是將支原體污染的細胞注射到小鼠腹腔。經(jīng)24 h或48 h后，將小鼠腹水抽出（ 腹水已含注入的細胞） ,經(jīng)離心后收集細胞于培養瓶?jì)扰囵B[19].因在日常細胞培養過(guò)程中支原體的污染常被忽視，為了避免損失可 定 期 對 實(shí) 驗 室 中 的 培 養 物 進(jìn) 行 支 原 體 檢測[20].
4 病毒污染
病毒污染特點(diǎn)是極為隱蔽，很難用常規的方法檢測到[21].受病毒污染的細胞液通常清亮無(wú)變化。污染分為外源性和內源性[19,22],污染的主要來(lái)源為細胞系，常見(jiàn)于雜交瘤細胞[4].大多數受病毒污染的細胞不會(huì )產(chǎn)生形態(tài)變化及細胞病理現象[19],少部分病毒會(huì )造成細胞變圓、腫脹，脫落[21].
疑病毒污染后，可用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒[19].通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細胞株。
5 黑膠蟲(chóng)污染
黑蛟蟲(chóng)是一種生物還是非生物，學(xué)術(shù)界還有爭論。其污染特點(diǎn)為開(kāi)始對細胞無(wú)影響，當數量達到一定程度時(shí)就會(huì )對細胞產(chǎn)生影響[23].受黑蛟蟲(chóng)污染的細胞液通常清亮無(wú)變化。污染主要來(lái)源于血清，400倍顯微鏡下可見(jiàn)點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體。
黑蛟蟲(chóng)早期污染一般采用如下方法： 用0. 25%的胰酶消化，當有少量細胞變圓或脫壁時(shí)，用血清終止消化，輕輕用培養基或D-Hanks液清洗3遍（ 緩慢流過(guò)細胞表面） ,不要吹打，然后吹散細胞，換培養瓶培養，隔天換液。2 d后重復一次，以后每24 ~ 36 h換1次液，1周后，黑點(diǎn)可基本消失。也可用麥諾霉素10 mg /L處理，連續1周，但麥諾霉素對細胞有毒性[23].
6 細胞的交叉污染
細胞的交叉污染一般來(lái)自細胞建株和細胞傳代過(guò)程中兩種或兩種以上細胞之間的污染[19].鏡下可發(fā)現細胞的形態(tài)發(fā)生改變，與正常該細胞株的形態(tài)不同。
關(guān)于細胞系的種系來(lái)源可以通過(guò)各種免疫學(xué)試驗、同功酶分析及細胞遺傳學(xué)方法來(lái)確定。其中以熒光抗體染色法和同功酶譜系分析法應用較廣泛。同功酶分析法不僅可以鑒別細胞種屬，而且可以鑒別種內細胞的交叉污染[19].若發(fā)生細胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放棄細胞。為避免細胞的交叉污染，在進(jìn)行多種細胞培養操作時(shí)，所用器具要嚴格區分，最好做上標記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)發(fā)生混亂。在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞[23].
7 結 語(yǔ)
細胞一旦發(fā)生污染，任何一種挽救細胞的處理可能都會(huì )對細胞產(chǎn)生不良或未知的影響，因此如果不是不易獲得的細胞，實(shí)驗者都應該抱著(zhù)嚴謹平和的態(tài)度重新開(kāi)始。細胞培養中污染的來(lái)源主要有以下幾種途徑：1） 細胞組織本身帶有污染；2） 實(shí)驗室內空氣不潔凈；3） 實(shí)驗操作者未能?chē)栏褡袷夭僮饕幊蹋?） 生物安全柜不潔凈或使用不正確；5） 實(shí)驗中所用的器具和培養基消毒不徹底。因此實(shí)驗者應從以上幾方面盡量避免細胞污染，才能保證實(shí)驗的有序進(jìn)行。
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