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研究外界條件的改變對紅花離體培養的影響
摘要：目的研究外界培養條件的變化對紅花離體培養過(guò)程中不同發(fā)育階段培養物的影響。方法以紅花種子誘導的無(wú)菌苗子葉為外植體，分別接種至含有不同碳氮源、不同PH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的培養基中，觀(guān)察其生長(cháng)情況。結果通過(guò)實(shí)驗篩選出蔗糖濃度為3%，KNO3濃度為MS培養基中KNO3濃度的2倍，最佳pH為6.2，紅花離體培養體系在24℃，30%的相對濕度，16 h光照，8 h黑暗交替培養的條件下，最利于紅花的分化。結論3%的蔗糖作為碳源，最適合愈傷組織的生長(cháng);2倍于MS培養基中的KNO3含量有利于愈傷組織的生長(cháng)和不定芽的分化;pH值為6.2時(shí)，最適宜紅花不同階段培養物的生長(cháng);24℃為紅花離體培養的最適溫度，生根時(shí)的溫度為21℃較好;濕度為50%時(shí)，適于愈傷組織鮮重積累，30%的濕度適于不定芽分化和生根;黑暗培養利于鮮重積累，16 h光照，8 h黑暗交替培養有利于不定芽的分化，8 h光照，16 h黑暗交替培養有利于生根。
關(guān)鍵詞： 紅花愈傷組織; 不定芽; 蔗糖 ; 氮源; pH值; 溫度; 濕度; 光照
紅花為菊科一年或二年生雙子葉草本植物，喜溫暖、干燥氣候，抗寒性強，耐鹽堿。紅花全身是寶，花、籽粒、莖葉、秸稈等均可綜合利用，是一種集藥材、油料、染料為一體的特種經(jīng)濟作物[1]。由于紅花無(wú)性快繁體系很難建立，并且目前國內對紅花離體培養的研究很少，因此本文通過(guò)改變不同的培養條件來(lái)研究紅花無(wú)性快繁體系的建立，以期有利于紅花的資源保護、擴大繁殖和進(jìn)一步推廣應用。
1 材料與方法
1.1 材料紅花種子由新疆塔城種子公司提供; 實(shí)驗以采收后1年后的紅花種子不同日齡無(wú)菌苗子葉作為外植體。
1.2 方法紅花種子，經(jīng)70%酒精清洗30 s， 0.1 %升汞表面滅菌10 min, 無(wú)菌水洗4～5次，接種到種子萌發(fā)培養基: 1/2MS 1.5%蔗糖 1 mg·L-1GA中，取接種7日齡的紅花無(wú)菌苗子葉作為外植體, 分別接種至含有不同碳氮源、不同pH值、不同溫度、不同濕度和不同光照的愈傷組織誘導培養基和中;培養一段時(shí)間后，測定愈傷組織的鮮重增長(cháng)量。
子葉完全愈傷化以后，將其轉入不同pH值的分化培養基中，誘導不定芽的產(chǎn)生。設置不同的溫度梯度和不同光照強度的條件，培養25 d后，觀(guān)察不定芽的形成情況，觀(guān)察分化情況，待不定芽形成以后，將其移至生根培養基中，每20 d繼代1次，觀(guān)察生根情況。
2 結果
2.1 碳源在紅花愈傷組織生長(cháng)過(guò)程中的作用碳源既是重要的能源物質(zhì)，也是一種重要的滲透壓調節物質(zhì)，對植物離體形態(tài)發(fā)生起著(zhù)非常重要的作用。而碳源的主要提供形式是糖類(lèi)物質(zhì)，其中以蔗糖最為普遍，蔗糖是植物體內糖類(lèi)運輸的主要形式，也是某些植物貯藏的主要化合物。有研究認為，蔗糖的濃度對于組織培養很重要，適當的濃度對于維持培養基滲透勢，提高植物組培再生頻率具有重要意義。因此，本實(shí)驗探討了不同的蔗糖濃度在紅花脫分化過(guò)程中起的作用，分別取1%～7%的蔗糖添加到培養基中，結果見(jiàn)圖1，以紅花愈傷組織鮮重增長(cháng)量計算，培養基中加入的蔗糖含量在1%～3%范圍內，鮮重增長(cháng)量呈上升狀態(tài)，蔗糖含量在3%～7%范圍內，紅花愈傷組織的鮮重增長(cháng)量呈下降趨勢，蔗糖含量在3%時(shí)，愈傷組織鮮重增長(cháng)量出現峰值，達到6.8 g，蔗糖含量低于3%時(shí)，在培養初期，鮮重增長(cháng)迅速，培養后期，鮮重增長(cháng)緩慢，以致收獲時(shí)，生物積累量不高，蔗糖含量高于3%時(shí)，鮮重增長(cháng)量明顯下降，說(shuō)明蔗糖含量過(guò)高，不利于細胞生物量的積累。
圖1 碳源對紅花愈傷組織生長(cháng)的影響
2.2 氮源對紅花愈傷組織生長(cháng)的影響培養基成分影響植物離體形態(tài)發(fā)生的效果，在植物組織培養過(guò)程中，KNO3和NH4NO3是兩個(gè)重要的氮素來(lái)源，其含量高低可影響愈傷組織生長(cháng)、離體形態(tài)發(fā)生，且不同植物、不同的離體培養時(shí)期對KNO3和NH4NO3的需求亦不同。在紅花愈傷組織培養基中添加了不同濃度的KNO3和NH4NO3，觀(guān)察二者對紅花愈傷組織、不定芽和生根情況的影響。由表1可知，NO-3和NH4 均有利于細胞生長(cháng)，當MS培養基中去除NH4NO3，僅加入KNO3時(shí)，細胞生長(cháng)緩慢，不定芽分化率極低，但分化出的不定芽伸長(cháng)略有伸長(cháng);當MS培養基中僅加入NH4NO3，去除KNO3時(shí)，細胞生長(cháng)極其緩慢，對不定芽的分化及生根沒(méi)有促進(jìn)作用;在MS培養基中加入2倍KNO3時(shí)，細胞生長(cháng)快速，比正常高出4.6%，不定芽分化效果較好，對不定芽伸長(cháng)起到明顯的促進(jìn)作用，生根情況與正常接近;在MS培養基中加入2倍NH4NO3時(shí)，細胞生長(cháng)一般，比正常低出6.2%，不定芽分化效果與正常MS接近，對不定芽伸長(cháng)起抑制作用，生根情況與正常MS接近。因此說(shuō)明，①細胞生長(cháng)量的積累和不定芽的分化、伸長(cháng)所需的氮源均不是單一形式的，既需要硝態(tài)氮又需要氨態(tài)氮，只有二者配合使用才能達到理想效果;② KNO3的含量加倍有利于細胞生長(cháng)量的積累，同時(shí)還利于紅花不定芽的分化，對不定芽的伸長(cháng)起到明顯的促進(jìn)作用;③NH4NO3的含量加倍，對不定芽的伸長(cháng)起到抑制作用。表1 氮源對紅花愈傷組織生長(cháng)的影響“-”表示無(wú) ; “ ”表示生長(cháng)緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.3 紅花培養物在不同酸堿性培養基中的生長(cháng)情況基質(zhì)初始pH 值是植物組織和細胞培養的主要影響因子，它直接影響培養物的生長(cháng)、分化和物質(zhì)積累�；|(zhì)最適初始pH值一般為5.0～6.0，但因植物培養的不同種類(lèi)、不同部位及不同生理狀態(tài)而異。本實(shí)驗將培養基的pH值設置5個(gè)梯度，分別為5.4，5.8，6.0，6.5，7.0觀(guān)察其對紅花培養物的影響。結果見(jiàn)表2，pH值的變化對愈傷組織的鮮重、不定芽的分化和生根均有一定影響。在一定范圍內，鮮重增長(cháng)量隨pH值的上升而上升，pH值為6.2時(shí)，達到峰值，之后又隨之下降。當培養基偏酸性即pH值為5.4時(shí)，不定芽的分化率低，葉片為淺綠色、水分含量高;pH值為6.2時(shí)，不定芽分化數量相對較多，且葉片顏色深綠，水分含量少，抗逆性強;當培養基為中性即pH值為7.0時(shí)，不定芽分化極少，可能是由于中性環(huán)境的培養基過(guò)硬，不利于生長(cháng)調節物質(zhì)在胞內的運輸，以致愈傷組織難以吸收養分，難以分化形成不定芽。
2.4 溫度對紅花培養物的影響紅花分為春播和復播，春播紅花適宜期在4月上旬; 春播紅花在5月份處于出苗、分枝期,溫度較適宜。復播在6月左右，復播紅花7、8月處于苗期和花期生長(cháng)階段, 出苗期間氣溫偏高，出苗速度加快，花期是紅花開(kāi)花授精、籽粒開(kāi)始形成的關(guān)鍵時(shí)期，故生長(cháng)期間需要有較好的光熱及水肥條件,要求日平均氣溫保持在25～27℃。本實(shí)驗將培養物分別置于18℃，21℃，24℃，27℃，30℃下培養，比較不同溫度對培養物的培養效果，結果見(jiàn)表3，24℃是愈傷組織培養的最佳溫度，24～27℃形成的不定芽狀態(tài)都較好，但21℃生根效果較好。這證明了較高的氣溫利于出苗。表2 pH值對紅花生長(cháng)的影響“-”表示無(wú) ; “ ”表示生長(cháng)緩慢 ; “ ”越多表示效果越好
2.5 濕度對紅花培養物的影響紅花有強大的直根(根深達213 c
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