氟西汀對海馬神經(jīng)元生長(cháng)的影響

氟西汀對海馬神經(jīng)元生長(cháng)的影響

【關(guān)鍵詞】 氟西汀;細胞培養;海馬神經(jīng)元;大鼠

　　氟西汀是5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑之一，是應用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治療其他中樞神經(jīng)系統疾病。有研究表明，氟西汀對海馬的神經(jīng)保護作用是其發(fā)揮抗抑郁效應的機制之 一［1］。關(guān)于氟西汀對體外培養的海馬神經(jīng)元生長(cháng)的影響未見(jiàn)報道，本研究初步探討了氟西汀對原代培養的海馬神經(jīng)元生長(cháng)的影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養

　　技術(shù)方法在參考文獻［2］基礎上加以改進(jìn)。取出生24 h內的新生SD大鼠（東南大學(xué)醫學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗中心提供），無(wú)菌分離出雙側海馬，用顯微剪剪碎，D-Hank's液清洗2或3次，將剪碎的海馬組織轉移至離 心管中，加入等量0.25%的胰酶（美國Sigma公司），37 ℃消化30 min，中間振搖1或2次，加入10%的 DMEM/F12（美國Gibco公司）5 ml，輕輕吹打15次，然后1 000 r · min-1離心5 min，制成單細胞懸液，置于CO2 培養箱（德國Heraeus公司產(chǎn)品）中，差速貼壁30min，去除成纖維細胞，吸取未貼壁的細胞，并用200目 的不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾后的單細胞懸液于培養皿中，然后至離心管中，取一滴單細胞懸液進(jìn)行計數，并用DMEM/F12將細胞密度調到1×106ml-1，然后接種于200 μg·ml-1多聚賴(lài)氨酸（美國Sigma公司）包被的6孔培養板中，轉移至培養箱內培養，4 h后換為 無(wú)血清培養基，即含2% B27的Neurobasl培養基（美國Gibco公司），以后每3天半量換液1次。使用培養 6 d的神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定。

　　1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

　　1.2.1 烯醇化酶（NSE）免疫細胞化學(xué)染色

　　取培養6 d 6孔培養板中的蓋玻片進(jìn)行神經(jīng)元特異的NSE免 疫組織化學(xué)染色。棄去培養液，4%多聚甲醛室溫固定1 h ，加入 0.3% H2O2甲醇去除內源性過(guò)氧化氫酶，0.1% TritonX-100破膜，10%綿羊血清封閉，加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗體，4 ℃濕盒過(guò)夜，0.01 mmol ·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入 37 ℃溫箱孵育 60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗，滴加SABC過(guò)氧化物酶復合物，37 ℃溫箱中孵育 60 min，0.01 mmol · L-1PBS清洗，滴加 DAB顯色液作用3～10 min，自來(lái)水沖洗后，常規脫水，透明封片。光鏡下觀(guān)察NSE表達陽(yáng)性細胞。

　　1.2.2 尼氏染色

　　6孔培養板的細胞培養7d時(shí)，取出蓋玻片進(jìn)行尼氏染色。棄去培養液，0.01 mmol · L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定1 h，0.01 mmol · L-1PBS清洗 3次，氯仿中1 min，95%、70%乙醇各1 min， 蒸餾水清洗，置于1%甲苯胺藍染液中染色20 min，95%乙醇分化，在顯微鏡下觀(guān)察控制，時(shí)間以尼氏體顯示清晰為準，37 ℃干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察。

　　1.3 實(shí)驗分組

　　在培養的第3天加入氟西�。ǔＶ莸谒闹扑帍S(chǎng)生產(chǎn)），根據藥物濃度不同，將實(shí)驗細胞分為5組，分別加 入1、10、20、40 μmol · L-1氟西汀;正常對照組加入等體 積的培養基。

　　1.4 海馬細胞形態(tài)定量分析

　　倒置相差顯微鏡（德國Zeiss公司產(chǎn)品）下觀(guān)察加 藥48 h后的海馬神經(jīng)元形態(tài)，每組各孔隨機選擇20個(gè)視野（每個(gè)視野0.17 mm2），記錄每個(gè)視野內細胞長(cháng)出突起的神經(jīng)元數目，目鏡測微尺隨機測量15個(gè)神經(jīng)元突起的長(cháng)度和胞體的長(cháng)徑。

　　1.5 統計學(xué)處理

　　應用SPSS12.0軟件進(jìn)行統計分析，各項檢測結果以x-±s 表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。

　　2 結 果

　　2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀(guān)察

　　倒置相差顯微鏡下觀(guān)察，培養1 d，細胞絕大部分貼壁，細胞形態(tài)大小不一，以單突起的小細胞為主。培 養6 d，神經(jīng)元胞體較大，突起進(jìn)一步增多、延長(cháng)，并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò )（圖1）。培養12 d，神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增 大，突起形成比較稠密的網(wǎng)絡(luò )。培養24 d，神經(jīng)元胞體出現空泡，部分神經(jīng)元死亡，胞體崩解，突觸斷裂。

　　2.2 海馬神經(jīng)元鑒定

　　NSE免疫細胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀(guān)察第6 天的神經(jīng)細胞，胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體 表達陽(yáng)性細胞，以3個(gè)視野中陽(yáng)性神經(jīng)元的數目占總細胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為 90%。見(jiàn)圖2A。

　　2.3 氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

　　結果見(jiàn)表1和圖3。不同濃度的氟西汀對海馬神 經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標的影響是不同的，10 μmol · L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起的神經(jīng)元數 目增加、最長(cháng)突起長(cháng)度增長(cháng)（ P

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