膀胱癌細胞凋亡與MDM2和P53基因表達的意義

作者：楊承綱，張麗娟，李梅，陳蕓
【關(guān)鍵詞】 膀胱腫瘤；P53基因；MDM2基因；免疫組織化學(xué)；細胞凋亡
［摘 要］ 目的：研究膀胱癌細胞凋亡、MDM2、P53基因表達的意義。方法：采用免疫組織化學(xué)方法及TUNEL法檢測11例“正常膀胱黏膜”和83例膀胱移行細胞癌中MDM2、P53基因的表達及細胞凋亡指數。結果：P53陽(yáng)性率為50.6%,MDM2陽(yáng)性率為59.03%，AI=1.433 5±0.386 3。MDM2陽(yáng)性表達與病理分級及臨床分期呈負相關(guān)(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001);P53陽(yáng)性表達與病理分級及臨床分期呈正相關(guān)(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P＜0.01);MDM2、P53三種蛋白間表達無(wú)相關(guān)性；AI與MDM2呈負相關(guān)（R=-0.226,P=0.042）；AI與病理分級及臨床分期呈正相關(guān)(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI與P53無(wú)相關(guān)性。AI、P53、MDM2的表達與5 a生存率有關(guān)。結論：聯(lián)合運用臨床分期及病理分級并檢測P53、MDM2可用于判斷膀胱移行細胞癌的預后。
　�。坳P(guān)鍵詞］ 膀胱腫瘤；P53基因；MDM2基因；免疫組織化學(xué)；細胞凋亡
　　Clinical Significance of Expression of MDM2 P53 Protein and Apoptosis in Bladdercancer
　　Abstract：Objective To investigate the expression of MDM2 Pgp protein and apoptosis and its significance in bladder cancers.Methods Apoptosis Index(AI) was assessed with TUNEL technique,and immunohistochemical stainings of MDM2 and Pgp were performed in 83 cases of the carcinomas and 11 “normal” bladder mncosa.Results The positive expression rate of P53 gene was 50.6% and MDM2 was 59.03%,and AI=1.433 5±0.386 3.The level of MDM2 was negative correlated with the tumor pathological grade and clinical stage(R=-0.263,P=0.016及R=-0.388,P=0.001);The level of P53 was positive correlated with the tumor pathological grade(R=0.492,P=0.001);No correlated was found between MDM2 and P53 gene;The level of AI was negative correlated with MDM2(R=-0.226,P=0.042);The level of AI was positive correlated with the tumor pathological grade and clinical stage (R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000);The level of AI was no correlated with P53.AI and the expression of P53 and MDM2 were related to 5year survival rate.Conclusion By exerting the tumor pathological grade and clinical stage and detecting P53 MDM2 genes expressions,the prognosis of bladder cancer can be decided.論文網(wǎng)在線(xiàn)
　　Key words：Bladder neoplasm；P53 gene；MDM2 gene；Immunohistochemistry；Apoptosis
MDM2基因是一原癌基因，與P53構成降解反式激活循環(huán)通路，參與細胞生長(cháng)抑制、凋亡、細胞周期調控等過(guò)程。細胞凋亡是由基因調控的細胞主動(dòng)死亡過(guò)程，同腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及臨床治療有密切的關(guān)系。本研究采用免疫組化方法觀(guān)測MDM2、P53基因在人膀胱癌細胞中的表達及用TUNEL法檢測細胞凋亡，探討它們在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其對膀胱癌生物學(xué)行為和預后的影響。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料 收集本院病理科1996年至2004年間膀胱移行細胞癌83例及11例正常膀胱黏膜組織，83例膀胱移行細胞癌中男性66例，女性17例，年齡35歲~82歲，平均年齡58.5歲。病理檢查前均未接受過(guò)放療和化療，術(shù)后均進(jìn)行化療藥物膀胱灌注。按1999年WHO病理組織學(xué)分級標準，Ⅰ級29例，Ⅱ級31例，Ⅲ級23例；按UICC臨床分期，TisT1期61例，T2T4期22例。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片。術(shù)后隨訪(fǎng)16個(gè)月~5 a，平均38個(gè)月，失訪(fǎng)5例，腫瘤復發(fā)或轉移56例，死亡2例，無(wú)復發(fā)或轉移20例。
　　1.2 方法
　　1.2.1 陰性、陽(yáng)性檢測 MDM2、P53單抗均購自福州邁新公司。采用SP法進(jìn)性免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。結果判定：MDM2、P53以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽(yáng)性細胞，陽(yáng)性細胞＞10%為陽(yáng)性結果，反之為陰性結果（見(jiàn)圖1，圖2）。
　　圖1 P53陽(yáng)性表達于腫瘤細胞核，呈棕黃色顆粒(SP×400)（略）
　　圖2 MDM2陽(yáng)性表達于細胞核呈棕黃色顆粒（SP×400）（略）
　　1.2.2 凋亡個(gè)數檢測 細胞凋亡檢測（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的xdUTP切口末端標記，terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTPnick end labeling method,TUNEI法）試劑盒，DAB顯色試劑盒購于福州邁新公司。步驟：切片脫蠟水化，3%H2O2清除內源性過(guò)氧化酶10 min，蒸餾水洗滌2 min共洗3次；加TBS1∶100蛋白酶K，37 ℃消化10 min，蒸餾水洗滌2 min共洗3次；每片加TDT和DIGdUTP各1 μl，標記緩沖液18 μl，4 ℃冰箱過(guò)夜，TBS洗2 min共洗3次；加封閉液50 μl，室溫30 min；封閉液1∶100生物素化地高辛抗體50 μl，37 ℃反應30 min；TBS洗2 min共洗3次；加TBS1∶100稀釋SABC，37 ℃反應30 min；TBS洗5 min共洗4次；DAB顯色，蘇木素襯染，脫水、透明、封片。實(shí)驗中以不含TDT的試劑作陰性對照。結果判定：TUNEL法檢測陽(yáng)性表現為在腫瘤組織中散在分布胞核呈棕黃色顆粒著(zhù)色的細胞(見(jiàn)圖3)。在400倍光鏡下，隨機選擇10個(gè)視野并計數1 000個(gè)腫瘤細胞，記錄凋亡細胞數。計算細胞凋亡指數（AI），AI=（凋亡細胞數/1 000）×100%［1］。
　　圖3 細胞凋亡陽(yáng)性表現為腫瘤細胞核呈棕黃色顆粒（×400）（略）
　　1.3 統計方法 實(shí)驗數據經(jīng)SPSS統計軟件包處理，數據以±s表示，采用t檢驗，方差分析，相關(guān)分析，cox多因數分析，以P＜0.05作為差異有顯著(zhù)意義的檢驗標準。
　　2 結果
　　2.1 檢查 83例膀胱移行細胞癌中,有42例(50.6%) P53陽(yáng)性,49例(59.03%) MDM2陽(yáng)性，AI=1.433 5±0.386 3。
　　2.2 病理分級及臨床分期中比較 MDM2Ⅰ級、Ⅱ級與Ⅲ級間表達差異有顯著(zhù)性(P＜0.05)，Ⅰ級與Ⅱ級間表達差異無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)；P53Ⅰ級與Ⅱ、Ⅲ級間表達差異有顯著(zhù)性(P＜0.05)，Ⅱ級、Ⅲ級間表達差異無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)。MDM2在TaT1與T2T4間表達差異有顯著(zhù)性(P＜0.05）,P53在兩組中表達差異無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)。AI在Ⅰ級、Ⅱ級與Ⅲ級間表達及TaT1與T2T4間表達差異有顯著(zhù)性(P＜0.01)。相關(guān)分析發(fā)現,MDM2陽(yáng)性表達與病理分級及臨床分期呈負相關(guān)(R=-0.263,P=0.016；R=-0.388,P=0.001);P53陽(yáng)性表達與病理分級及臨床分期呈正相關(guān)(R=0.492,P=0.001；R=0.341，P=0.002);MDM2、P53兩種蛋白間表達無(wú)相關(guān)性；AI與MDM2呈負相關(guān)（R=-0.226,P=0.042）；AI與病理分級及臨床分期呈正相關(guān)(R=0.642,P=0.000；R=0.455，P=0.000)；AI與P53無(wú)相關(guān)性。5 a隨訪(fǎng)AI及P53復發(fā)死亡組顯著(zhù)高于無(wú)復發(fā)組；MDM2復發(fā)死亡組顯著(zhù)低于無(wú)復發(fā)組。詳見(jiàn)表1。
　　2.3 MDM2基因在P53基因陽(yáng)性表達在膀胱癌中的表達 分析發(fā)現P53陽(yáng)性表達合并MDM2陽(yáng)性表達多見(jiàn)于分化好的膀胱癌Ⅰ級、Ⅱ級與Ⅲ級間表達差異有顯著(zhù)性(P＜0.05詳見(jiàn)表2。
　　表1 Pgp、MDM2、P53表達與病理分級及臨床分期的關(guān)系（略）
　　注：*P＜0.05**P＜0.01
　　表2 MDM2基因在P53基因陽(yáng)性表達膀胱癌中的表達（略）
　　注：*P＜0.05

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