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分析方法的驗證的相關(guān)論文材料
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分析方法的驗證，就是對藥品分析實(shí)驗所采用的分析方法是否完全達到了預期目的，或證明由分析方法誤差而導致試驗結果判斷錯誤的概率是否在允許范圍之內，而進(jìn)行的科學(xué)證明。
分析方法的驗證以驗證參數表示。在制定藥品質(zhì)量標準時(shí)，可通過(guò)這些參數證明所建立的分析方法是否適當。本文所述分析方法驗證是指下述情況：藥局方新收載品種質(zhì)量標準的建立；藥局方已收載品種質(zhì)量標準的修訂；根據藥局方的通則建立替代方法。
1 日本藥局方收載分析方法所需資料
1.1 概要 對分析方法作簡(jiǎn)要說(shuō)明，包括所采用分析方法的必要性，特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)及有關(guān)驗證的要點(diǎn)。如系分析方法的修訂，則需闡明新方法與原方法的區別以及新方法的優(yōu)勢。
1.2 分析方法 本項記載的有關(guān)分析方法的內容要足以能對分析方法進(jìn)行評價(jià)，并且必要時(shí)可用復核試驗進(jìn)行評價(jià)。分析方法主要記載內容包括：分析的步驟、標準品及樣品的制備方法、試劑與試藥的調配、注意事項、分析系統是否正常運轉的檢驗證明方法(例如高效液相色譜法中的分離效率的研究)、分析結果的計算公式、測定次數等。并且，如果使用了藥局方以外的裝置，還需詳述有關(guān)內容；如果使用了新的標準品，則必須提供其物理、化學(xué)及生物學(xué)特征數據，并提供其質(zhì)量標準。
1.3 有關(guān)分析方法驗證的資料 本項應包括求導各驗證參數的試驗設計、試驗數據、計算結果及檢定結果等。
2 驗證參數(validationcharacterisitics)
分析方法適當與否可通過(guò)驗證參數進(jìn)行評價(jià)，下面列舉了最典型的分析方法驗證參數的定義及其評價(jià)方法。
驗證參數的有關(guān)術(shù)語(yǔ)及定義因分析方法的應用領(lǐng)域不同而不同，本文所使用的術(shù)語(yǔ)及定義僅限于日本藥局方。評價(jià)方法項下所述內容也僅為簡(jiǎn)要概述。確定驗證參數的方法很多，采用何種方法沒(méi)有具體限制。但是，驗證參數的限值常因確定方法的不同而發(fā)生變化。故此，確定驗證參數的實(shí)驗方法、實(shí)驗數據、計算方法等應盡可能詳細地記述。
本文分析方法驗證中未包括驗證參數適應性/牢固性(Robustness)的討論，這是由于牢固性的研究主要在分析方法的開(kāi)發(fā)設計階段進(jìn)行，其研究結果可以在方法的分析條件或注意事項中得到體現。
2.1 真度/準確度(Accuracy/Trueness)
2.1.1 定義：所謂準確度，指分析方法所得測定值的偏離程度，通常以測定值的總平均值與真值之間的差來(lái)表示。
2.1.2 評價(jià)方法：準確度一般以測定室內重現精度或室間再現精度時(shí)所得總平均值與真值的差表示。真值一般使用理論值(如滴定法)，如果理論值不存在或即使存在但很難求出的情況下，可采用經(jīng)過(guò)確證或認可的數值來(lái)代替(如制劑分析常以原料藥的測定值作為真值)。分析方法的專(zhuān)屬性強，可以推斷其分析方法的誤差就小。由推出的真值與室內(室間)再現精度的標準偏差即可計算出真值的95%置信區間，并可判斷這個(gè)區間是否包括0點(diǎn)，或區間的上下限值是否在分析方法所要求的精度范圍之內。
2.2 精密度(Precision)
2.2.1 定義：精密度是指從均勻樣品中抽取的復數個(gè)供試品進(jìn)行重復分析測定時(shí)，所得到的一系列測定數據彼此之間的一致程度。測定值的誤差以偏差、標準偏差、或相對標準偏差的形式表示。精度根據重復實(shí)驗的條件不同以三個(gè)水平表示，分別稱(chēng)為：并行精度、室內再現精度、室間再現精度。
并行精度(Repeatability/Intra-assayprecision)：指實(shí)驗室、實(shí)驗者、實(shí)驗日期、裝置、器具以及試藥的批號等實(shí)驗條件均未改變的情況下，從均勻樣品中抽取的復數個(gè)供試品短時(shí)間內進(jìn)行重復分析測定時(shí)(并行條件)的精度。
室內再現精度(Intermediateprecision)：指同一實(shí)驗室內，實(shí)驗者、實(shí)驗日期、裝置、器具以及試藥的批號等實(shí)驗條件一部分或全部改變的情況下，從均勻樣品中抽取的復數個(gè)供試品進(jìn)行重復分析測定時(shí)(室內再現條件)的精度。
室間再現精度(Reproducibility)：指在不同實(shí)驗室間，從均勻樣品中抽取的多個(gè)供試品進(jìn)行重復分析測定時(shí)(室間再現條件)的精度。
2.2.2 評價(jià)方法：首先，要保證精度研究所用樣品的數量和均勻性。溶液應為均勻性樣品，在得不到均勻性樣品時(shí)，通常將大量制劑粉碎混合至認為均勻或制劑的各組分混合至認為均勻的樣品作為均勻性樣品使用。如果同時(shí)做兩個(gè)水平以上的精度評價(jià)時(shí)，可以采用諸如單因素方差分析等實(shí)驗方法，但為了正確得出分析方法的精度，必須有足夠的實(shí)驗次數、分析條件的水平數及實(shí)驗室數。并且要對可預想到的致使分析發(fā)生變化的要因進(jìn)行研究。各水平的精度以偏差、標準偏差、相對標準偏差、偏差的90%置信區間以及與其相對應的標準偏差的區間來(lái)表示。將其與分析方法所要求精度的標準值進(jìn)行對照，以確定分析方法是否可行。通常是以室內(間)的再現精度作為方法取舍的依據。
2.3 專(zhuān)屬性/特異性(Specificity)
2.3.1 定義：專(zhuān)屬性指分析樣品中有共存物質(zhì)的情況下，對被測物質(zhì)進(jìn)行正確測定的能力，即表示分析方法的識別能力。如果分析方法的專(zhuān)屬性有個(gè)別缺陷，可以用其他方法加以補充。
2.3.2 評價(jià)方法：確證分析方法是否達到試驗目的，確實(shí)能夠對被測物質(zhì)進(jìn)行鑒別或定量。例如，分析方法的專(zhuān)屬性可以通過(guò)比較A為僅含被測物質(zhì)樣品(陽(yáng)性對照)；B為含有制劑的其他各組成成分及不純物或分解產(chǎn)物中添加被測物質(zhì)的樣品；C為不含被測物質(zhì)，僅含制劑的其他組分、不純物及分解產(chǎn)物的樣品(陰性對照)，根據A、B、C三種樣品的分析結果進(jìn)行評價(jià)。如果不純物不易得到時(shí)，可以用含有不純物的樣品(如經(jīng)時(shí)發(fā)生變化的樣品)替代。
2.4 檢出限界(Detection Limit)
2.4.1 定義：檢出限界是指樣品中所含的被測物質(zhì)可被檢出的最低量或濃度。在檢出限界內并不意味著(zhù)一定就能夠進(jìn)行定量。
2.4.2 評價(jià)方法：通常以消費者危險率及生產(chǎn)者危險率在5%以下來(lái)規定檢出限界。檢出限界可以通過(guò)空白樣品或檢出限界附近的樣品測定值的標準偏差以及檢出限界附近的標準曲線(xiàn)的斜率算出。例如，根據檢出限界附近的標準曲線(xiàn)的斜率以及空白樣品測定值的標準偏差，由下式求出檢出限界。
DL=3.3σ/slope
DL：檢出限界
σ：空白樣品測定值的標準偏差
slope：檢出限界附近標準曲線(xiàn)的斜率
應用色譜法時(shí)，測定值的標準偏差可以用信噪比代替。分析方法的檢出限界應比質(zhì)量標準中規定值要小。
2.5 定量限界(Quantitation Limit)
2.5.1 定義：定量限界是指樣品中所含的被測物質(zhì)可被進(jìn)行定量的最小量或最低濃度。定量限界所述樣品測定值的精度，以相對標準偏差表示，一般為10%。
2.5.2 評價(jià)方法：通常定量限界可以通過(guò)空白樣品或被測物定量限界附近的樣品測定值的標準偏差以及定量限界附近的標準曲線(xiàn)的斜率算出。例如，根據定量限界附近的標準曲線(xiàn)的斜率以及空白樣品測定值的標準偏差，由下式求出定量限界。
DL=10σ/slope
DL：定量限界
σ：空白樣品測定值的標準偏差
slope：定量限界附近標準曲線(xiàn)的斜率
應用色譜法時(shí)，測定值的標準偏差可以用信噪比代替。分析方法的定量限界應比質(zhì)量標準中規定值要小。
2.6 線(xiàn)性關(guān)系
2.6.1 定義：線(xiàn)性關(guān)系是指分析方法能夠得到與被測物質(zhì)的量或濃度具有直線(xiàn)關(guān)系的測定值的能力，必要時(shí)，被測物質(zhì)的量或濃度的測定值也可以是從數學(xué)公式中得到
的變換值。
2.6.2 評價(jià)方法：準備一系列不同濃度(量)的被測樣品，按照分析方法的操作步驟進(jìn)行測定，用測定值得到的回歸方程及相關(guān)系數對線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行評價(jià)。必要時(shí)，將測定值由回歸方程算出的殘差對被測物質(zhì)的量(濃度)作圖，不應具有某種特定的趨勢。通常，采用5個(gè)不同量(濃度)的樣品作線(xiàn)性關(guān)系的研究。
2.7 范圍(Range)
2.7.1 定義：分析方法驗證中所述范圍是指具有一定精度和準確度的被測物質(zhì)上限及下限量(濃度)之間的領(lǐng)域。對于上述具有線(xiàn)性關(guān)系的分析方法則指：具有一定精度和準確度，并且使線(xiàn)性關(guān)系成立的被測物質(zhì)上下限量(濃度)之間的領(lǐng)域。
2.7.2 評價(jià)方法：分析方法驗證的范圍一般為標準中規定值的±20%左右，對范圍的上下限值及范圍中央值附近的樣品進(jìn)行精度、真度及線(xiàn)性的研究討論。
3 試驗分析方法的分類(lèi)
根據試驗目的，試驗方法主要可以分為以下3種類(lèi)型，各類(lèi)型分析試驗方法的驗證所要求的驗證參數見(jiàn)表1。應該指出，這僅是一個(gè)原則，評價(jià)分析方法所必需的驗證參數將隨分析方法的特點(diǎn)及試驗目的而改變。
表1 試驗類(lèi)型與所要求的驗證參數
驗證參數類(lèi)型Ⅰ類(lèi)型Ⅱ類(lèi)型Ⅲ定量試驗限度試驗準確度-+-+精密度并行精度-+-+室內再現精度--*--*室間再現精度-+*-+*專(zhuān)屬性++++檢出限界--+-定量限界-+--直線(xiàn)性-+-+范圍-+-+ 注：-：一般不需要；+：需要；*：視情況而定。室內或室間再現精度選擇其一進(jìn)行評價(jià)，日本藥局方通常選擇后者進(jìn)行評價(jià)。
類(lèi)型Ⅰ需做鑒別試驗，即對藥品中的主要成分及其特征進(jìn)行鑒別。類(lèi)型Ⅱ需做檢查試驗，即對藥品中的雜質(zhì)或不純物的量進(jìn)行測定。類(lèi)型Ⅲ需做含量測定和溶出度試驗，即對藥品中的成分進(jìn)行測定(成分包括穩定劑、添加劑等)和藥品有效性試驗。
4 分析方法驗證用語(yǔ)
4.1 適應性/牢固性(Robustness) 指故意將分析條件在小范圍內變化時(shí)，測定值不受影響的能力。例如，反應的pH值、溫度、室間及試藥的量等分析條件在適當的范圍內改變時(shí)，對測定值的穩定性進(jìn)行研究討論。測定值對于分析條件不穩定時(shí)，應對方法加以改進(jìn)。適應性的研究結果在分析方法中以表示分析條件的有效數字或注意事項的形式得以體現。
4.2 實(shí)驗室 指試驗進(jìn)行的場(chǎng)所、設施。分析方法驗證中所述改變實(shí)驗室是指試驗者、裝置以及試藥的批號等試驗條件發(fā)生變化。
4.3 試驗法 指藥局方中的試驗方法，例如鑒別試驗、檢查試驗等。試驗方法應包括樣品的制備、規定值、分析方法等。
4.4 生產(chǎn)者危險率 指合格的制品由于試驗原因而錯判為不合格制品的發(fā)生概率。一般以α表示，也叫第一過(guò)失率，也就是在限度試驗中所說(shuō)的假陽(yáng)性率。
4.5 消費者危險率 指不合格的制品由于試驗原因而錯判為合格制品的發(fā)生概率。一般以β表示，也叫第二過(guò)失率，也就是在限度試驗中所說(shuō)的假陰性率。
4.6 測定次數 指分析方法操作程序中規定的次數，為了提高分析方法的精度，有些試驗明確規定試驗次數在2次以上，分析方法驗證是對包括分析方法所規定的測定次數在內的分析方法的評價(jià)。它與為了提高分析方法的精度進(jìn)行重復分析時(shí)的重復次數不同。
4.7 測定值 一次分析所得到的一個(gè)數值。
本文譯自第13版日本藥局方附錄參考資料3所載內容。
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