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淺析藍藻生物工程
[論文關(guān)鍵詞];藍藻生物；系統分類(lèi)；反應過(guò)程
[論文摘要];文章對藍藻生物工程進(jìn)行了研究和分析，希望有助于改善我們對相關(guān)問(wèn)題認識和理解。
藍藻也稱(chēng)藍細菌，是一種形態(tài)結構簡(jiǎn)單卻特殊并且種類(lèi)繁多、分布廣泛的原核生物。藍藻約有150屬,2000多種。多數藍藻及其提取物對人畜無(wú)毒,因此可成為物品、化妝品、食品飼料以及其它許多重要物質(zhì)的來(lái)源。
因此，對水華生物的準確鑒定、快速檢測和預警預報已成為當前水華研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，并具有重要的理論和實(shí)際意義。傳統的藻類(lèi)學(xué)鑒定方法是通過(guò)形態(tài)學(xué)的觀(guān)察來(lái)劃分的,形態(tài)學(xué)標準往往使檢測樣本中的一些種不能被辨別出,在水華發(fā)生的過(guò)程中,細胞的外型,產(chǎn)毒能力會(huì )發(fā)生變化,即使是在實(shí)驗室培養條件下,不同氮源藍藻的外形也會(huì )發(fā)生變化。目前各種新的檢測技術(shù)在逐步建立,已有檢測水華藍藻產(chǎn)毒特性的全細胞PCR檢測法以及依據16S rDNA基因保守區域設計引物用PCR方法檢測藍藻和微囊藻存在的報告。
1. 藍藻系統分類(lèi)研究
傳統的藍藻分類(lèi)和系統發(fā)育樹(shù)的建立是基于對其表型的比較分析，然而表型是基因和相互作用的結果，基因型相同的個(gè)體在不同的環(huán)境下可能表現出顯著(zhù)的表型差異，因此傳統的分類(lèi)方法可能受環(huán)境影響，而給分類(lèi)和系統發(fā)育研究帶來(lái)不確定性。分子系統學(xué)就是避開(kāi)生物形態(tài)結構差異的干擾，直接通過(guò)檢測生物體內大分子所包含的穩定遺傳信息，定量描述、分析這些信息在分類(lèi)、系統進(jìn)化和遺傳多樣性研究上的作用，從而在分子水平上解釋生物多樣性、系統發(fā)育及進(jìn)化規律的一門(mén)學(xué)科DNA分子作為遺傳信息的直接載體，個(gè)體中的每個(gè)體細胞都有相同的遺傳信息，因而能較為準確地反映出各個(gè)物種問(wèn)的系統產(chǎn)生關(guān)系。根據DNA序列所含有的遺傳信息來(lái)進(jìn)行分類(lèi)及系統進(jìn)化等研究已成為分子系統學(xué)研究的一個(gè)重要途徑近年來(lái)，DNA序列分析廣泛地被用于生物遺傳多樣性分析和生物類(lèi)群之間存在的種屬關(guān)系以及生物類(lèi)群的系統關(guān)系分析。
2. 藍藻基因工程研究
基本分為五大類(lèi)： 藻類(lèi)質(zhì)粒和限制內切酶研究、 藻類(lèi)內源基因的研究、藻類(lèi)外源基因的表達、藻類(lèi)毒素監測和藻類(lèi)監測。
目前，已經(jīng)出現檢測水華藍藻產(chǎn)毒特性的全細胞PCR 檢測方法 以及依據16S rDNA 基因保守區域設計引物用PCR 方法檢測藍藻和微囊藻存在的報告，以及選取的針對藍藻和微囊藻的16S rDNA 基因保守區域的特異性引物和針對微囊藻毒素基因 mcyB的一對特異性引物，試圖建立一種可以快速一次性得到這些信息的全細胞多重PCR方法，從而可以為長(cháng)期大規�？焖俦O測地表淡水水體提供一種有效手段。
3. 藻類(lèi)基因工程的研究技術(shù)及方法
主要分以下三大類(lèi)：轉移的載體系統、藻類(lèi)基因克隆的研究、藻類(lèi)的遺傳轉化
4. 藻細胞基因組DNA提取模板制備
采用早先1988年P(guān)orter 的方法，但是這個(gè)方法太古早，雖然可行，但是對于多項因素以及雜質(zhì)的干擾，細胞破除
的時(shí)間以及獲得的基因的利用度對于中國現狀的實(shí)驗來(lái)說(shuō)有待加強。
目前研究人員用于模板制備的方法基本有微波法、CTAB法、SDS法、水浴法等，但是由于地域、選擇的藻類(lèi)的不同、實(shí)驗方法以及目的的不同，研究人員都會(huì )在基本實(shí)驗方法基礎上稍加改動(dòng)以?xún)?yōu)化實(shí)驗。
5. PCR反應條件以及反應過(guò)程
PCR擴增是實(shí)驗的關(guān)鍵。PCR過(guò)程的優(yōu)劣直接關(guān)系到實(shí)驗成功與否。PCR反應中任何一種因素的變化，都有可能影響擴增結果。PCR擴增條件優(yōu)化主要包括以下幾個(gè)方面: 使用對比篩選過(guò)的引物令其具有良好的特異性、優(yōu)化的Taq酶濃度、優(yōu)化的Mg2+濃度、優(yōu)化的最佳退火溫度、優(yōu)化的循環(huán)時(shí)間、優(yōu)化的循環(huán)次數。甚至對不同研究目的，不同擴增儀器，不同公司和同一公司不同批次的試劑都應系統的摸索反應條件，優(yōu)化反應體系。最終篩選出PCR擴增的總體最佳條件組合以及排除各種干擾項，并在此相對最佳條件下進(jìn)行PCR法檢測藍藻的最低限量研究用以確定PCR法的檢測反應靈敏度。
[1]
�、� Taq酶活力的有無(wú)、高低直接關(guān)系著(zhù)擴增結果。Taq酶的用量一般為0.5一3.0U。Taq酶的活力過(guò)高可能導致非特異性擴增，過(guò)低則酶活不足而導致擴增條帶太弱。
�、� Mg2+主要作用是作為T(mén)aq酶的輔助因子，其濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì )影響Taq酶的活性。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著(zhù)降低;濃度過(guò)高對酶也有抑制作用。較低的Mg2+濃度擴增有較高的特異性，過(guò)高會(huì )導致非特異擴增產(chǎn)物的積累，背景模糊。
�、� 變性溫度過(guò)低，不能使靶基因模板和PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì )導致PCR擴增失敗。變性溫度一般在92一95℃，更高的溫度可能更有效，尤其對富含G一C的片段，但Taq酶在95℃可保持活力35min左右，高溫變性時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致Taq酶活力降低。
退火溫度決定了反應的特異性。在一定范圍內，退火溫度越高，PCR擴增特異性越高;但退火溫度過(guò)高，引物與模板DNA親和力太小甚至不能結合，會(huì )導致擴增產(chǎn)物量降低。
延伸溫度:現有的Taq酶最佳活力溫度范圍是65一75℃，一般72℃時(shí)酶活力最高。因此在擴增反應中，延伸溫度采用72℃。不合適的延伸溫度不僅影響擴增產(chǎn)物的特異性，而目.也會(huì )影響其產(chǎn)量。延伸時(shí)間取決于靶序列的長(cháng)度和濃度，延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致非特異性帶的出現。
�、� 循環(huán)次數決定擴增程度。在其他參數己優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)次數取決于靶序列的初始濃度，過(guò)多的循環(huán)增加非特異性擴增的數量和復雜性(平臺效應);循環(huán)次數太少，PCR產(chǎn)物量就會(huì )極低，擴增帶太弱甚至擴增陰性。PCR一般采用25一45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴增
6. PCR擴增時(shí)若操作不嚴格，很可能導致假陰性和假陽(yáng)性結果
假陰性主要是模板液中某些物質(zhì)，如殘留的極少量培養液成分、菌體蛋白等抑制了PCR反應;或者是pCR體系液中某成分失效所致，如dN丁P反復凍融降解、Taq酶活性下降、引物部分降解等都可能導致假陰性的結果。
假陽(yáng)性的造成，前人認為主要是擴增產(chǎn)物污染和標本間的交叉污染。擴增產(chǎn)物污染既是最嚴重，也是最容易發(fā)生的一種污染。因為經(jīng)過(guò)一次標準的PCR擴增，就可以產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物，即使最微小的氣溶膠微滴(10一6uL)，也可含有大量的靶分子。
由于PCR具有極高的靈敏性，在試驗設計中，研究人員們注意選用較低的Mg2十濃度和引物濃度、較高的退火溫度，可以一定程度上防止非特異性擴增和假陽(yáng)性的產(chǎn)生。假陽(yáng)性的原因在于核酸污染，而核酸污染來(lái)自?xún)煞矫?擴增產(chǎn)物污染以及樣品間DNA交叉污染。目前報導的解決擴增產(chǎn)物污染方法有兩種:尿嗯陡一N一糖基化酶解法和8一甲氧補骨酷素光化學(xué)法。但這兩種方法并不能防止樣品間DNA交叉污染。為了盡量避免假陽(yáng)性的出現，規范實(shí)驗程序可能更有實(shí)用價(jià)值，從實(shí)驗條件到操作上都嚴格要求
參考文獻
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