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新生SD大鼠神經(jīng)干細胞分離培養及分化研究
近年來(lái)，神經(jīng)干細胞的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，下面是小編搜集整理的一篇相關(guān)論文范文，歡迎閱讀查看。
神經(jīng)干細胞是存在于神經(jīng)系統內的一群具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1,2].近年來(lái)，神經(jīng)干細胞的研究成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)干細胞移植被認為是治療神經(jīng)系統損傷后修復和其他神經(jīng)系統疾病最具前景的方案之一[3].本研究采用新生24小時(shí)內清潔級SD大鼠作為供體，分離培養神經(jīng)干細胞，通過(guò)觀(guān)察、檢測神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞分化的生物學(xué)特性，為神經(jīng)干細胞的分化研究提供更多實(shí)驗依據。
1材料與方法
1.1實(shí)驗動(dòng)物
新生24小時(shí)內清潔2級SD大鼠，購于南方醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心。
1.2主要試劑
DMEM/F12培養基，D-Hank's液(Hyclone)，B27神經(jīng)細胞生長(cháng)添加劑(Gibco),bFGF、EGF(Peproteeh)，多聚賴(lài)氨酸(Sigma)，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。nestin抗體購自Chemi-con公司，NF 200和GFAP抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。臺盼藍、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。
1.3實(shí)驗方法
1.3.1 NSCs的原代分離培養NSCs的分離：取新生24小時(shí)內清潔級SD大鼠4只，用75%乙醇消毒頭部后，斷頭處死，在超凈臺內以眼科剪逐層剪開(kāi)頭皮及顱骨后，無(wú)菌條件下迅速取出端腦及中腦放入預冷的D-Hank's液中，去 除 腦 膜 及 血 管 后 剪 碎，加 入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4ml,37℃消化20~30min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基4ml終止消化，輕柔吹打至混懸液后，用400目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1000rpm離心5min,棄去上清，用D-Hank's重復清洗3遍后，加入完全培養基(含2%B27,20μg/L bFGF,20μg/L EGF的DMEM/F12培養基)重懸細胞懸液，臺盼藍染色計數后，調整細胞密度為1×106/ml接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。接種后的細胞每2~3d半量換液，培養6~7d傳代1次。逐漸去除碎片及其他細胞，分離出NSCs.
1.3.2 NSCs的傳代培養在原代培養第7天，無(wú)菌條件下進(jìn)行傳代培養。輕輕搖動(dòng)培養瓶，用吸管將沉在瓶底而沒(méi)有貼壁的神經(jīng)球收集入離心管，棄去貼壁的細胞，1500rpm離 心5min,吸去上清液后，加 入NSCs完全培養基，輕柔吹打使神經(jīng)球盡可能分離為單細胞懸液，計數后仍以1×106/ml接種于培養瓶中常規培養。此后每2~3d半量換液，培養6~7d傳代1次。
1.3.3 NSCs的免疫化學(xué)鑒定取生長(cháng)良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接種至預先放置多聚賴(lài)氨酸包被的無(wú)菌蓋玻片的24孔板內，繼續培養8小時(shí)，使大部分克隆球貼壁，將蓋玻片取出自然晾干。
PBS清 洗2次，每 次5 min,用4%多 聚 甲 醛 固 定30min后，PBS清洗干凈后以3% H2O2去離子水孵育10min,清洗3次，再以山羊血清封閉液37℃封閉10min.滴加一抗nestin(1∶100),37℃孵育2小時(shí)，PBS清洗3次，每次5min,滴加二抗B液37℃孵育20min,PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15min,具體步驟參照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)。
PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木素復染，封片。對照染色以PBS代替一抗，余相同。
1.3.4 NSCs的誘導多向分化取含生長(cháng)良好的第3代NSCs克隆球的細胞懸液，1500rpm離心5min,棄去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養液輕柔吹打為單細胞懸液后，接種于多聚賴(lài)氨酸包被的無(wú)菌蓋玻片的24孔板內，隨時(shí)觀(guān)察NSCs分化狀態(tài)，繼續培養7天后，進(jìn)行GFAP和NF 200的免疫細胞化學(xué)染色，方法步驟同nestin.
2結果
2.1 NSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察及免疫細胞化學(xué)鑒定倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀(guān)察原代培養NSCs,細胞懸液接種24小時(shí)后可見(jiàn)大量單個(gè)大小相近的圓形細胞，細胞核大，胞質(zhì)較少，折光性較高;2~3d半定量換液后可見(jiàn)較多懸浮生長(cháng)的形態(tài)不一的細胞球，呈桑椹狀，每個(gè)細胞球由數個(gè)到數十個(gè)細胞組成，折光性強，無(wú)突起生長(cháng);6~7d后，生長(cháng)成由上百個(gè)細胞組成的大克隆球(圖1a)。神經(jīng)細胞克隆球經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色后，神經(jīng)干細胞特異性表達的巢蛋白nestin呈強陽(yáng)性表達，胞漿呈棕黃色(圖1b).2.2 NSCs的誘導分化將培養第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基進(jìn)行誘導分化，12小時(shí)后可見(jiàn)到部分NSCs克隆球緊貼細胞培養瓶，許多偽足樣突起從克隆球中伸出;分化至第3天時(shí)，可見(jiàn)許多單個(gè)細胞逐漸從克隆球中遷出，細胞由圓形轉變?yōu)橛型黄鸬募毎?圖2)。培養至第7天時(shí)，細胞突起明顯增多，細胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò )狀結構。
2.3 NSCs誘導多向分化細胞的免疫細胞化學(xué)鑒定將NSCs培養至第7天時(shí)，細胞呈現多種形態(tài)，采用不同神經(jīng)細胞特異性抗體進(jìn)行免疫細胞化學(xué)鑒定。
結果顯示，星形膠質(zhì)細胞標記抗體GFAP在多角形胞體分化細胞的胞漿中呈陽(yáng)性表達(圖3a)。此類(lèi)細胞從胞體伸出許多長(cháng)的突起，連成網(wǎng)狀。神經(jīng)元標記抗體NF 200在卵圓形胞體分化細胞的胞漿中呈陽(yáng)性表達(圖3b)。該類(lèi)細胞發(fā)出突起相對較少，大部分細胞發(fā)出2個(gè)細胞突起。
3討論
近年來(lái)，NSCs已被研究證實(shí)廣泛分布于胚胎和成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統的若干區域。胚胎腦的端腦、海馬、紋狀體、中腦、室管膜/室管膜下區、脊髓和成年腦的腦室下區、紋狀體、海馬顆粒下區等已成功分離培養出NSCs[2].NSCs因其具有自我維持、自我更新、可遷徙性、轉分化性、低免疫原性、多向分化潛能等生理特性，使其成為基因治療的載體或供體細胞，且可在Ⅳ型膠原的誘導下分化為平滑肌細胞參與神經(jīng)組織血管再生，為臨床上脊髓損傷、帕金森病、周?chē)窠?jīng)損傷后肌肉萎縮的治療等提供了新的思路和方法[4~7].
本研究從新生24小時(shí)內清潔級SD大鼠的端腦及中腦成功地分離培養了NSCs,NSCs在含有能刺激神經(jīng)干細胞增殖的生長(cháng)因子B27、bFGF和EGF無(wú)血清培養液中大量增殖，呈懸浮球形生長(cháng)，并連續傳代生長(cháng)，體現NSCs自我維持和自我更新的特性。巢蛋白(nestin)是中間絲蛋白家族的成員，被列為第Ⅵ類(lèi)中間絲蛋白，該蛋白主要在神經(jīng)系統中的神經(jīng)干細胞及神經(jīng)前體細胞中表達，可以作為神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞以及胰島前體細胞的特異性標志物[8].巢蛋白的表達是暫時(shí)性的，一旦前體細胞分化成終末分化細胞 如神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，巢蛋白的表達便終止[9,10].我們的實(shí)驗結果可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)傳代培養的神經(jīng)細胞克隆球nestin呈強陽(yáng)性表達，表明了經(jīng)傳代培養的神經(jīng)細胞克隆球保持了神經(jīng)干細胞特性。當去除神經(jīng)干細胞增殖的生長(cháng)因子的作用，NSCs置 于含10%胎牛血清的DMEM/F12培 養 基 培 養3天 后，NSCs發(fā)生分化，不僅表現為細胞生長(cháng)方式發(fā)生改變，由懸浮生長(cháng)變?yōu)橘N壁生長(cháng)，而且細胞形態(tài)也發(fā)生了改變，由圓形分化為卵圓形、多角形等多種形態(tài)的有突起細胞。隨著(zhù)細胞的繼續分化，細胞突起明顯增多，分化細胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò )狀結構。成熟星形膠1酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元標記抗體NF 200.我們采用免疫細胞化學(xué)顯示，GFAP和NF200在分化細胞中呈陽(yáng)性表達，表明神經(jīng)干細胞經(jīng)過(guò)誘導分化后，部分細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，體現了NSCs的多向分化潛能。
4結論
通過(guò)從新生SD大鼠的腦組織成功分離、培養出NSCs,并且向星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元等方向分化，體現 了NSCs自我維持、自我更新和多向分化的基本特征。神經(jīng)干細胞的體外培養為后續神經(jīng)干細胞的分化研究提供了更多的實(shí)驗依據，對細胞移植治療中樞神經(jīng)系統疾病的研究具有重要意義。
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