- 相關(guān)推薦
簡(jiǎn)便有效分離培養大鼠主動(dòng)脈內皮細胞的一種新方法
畢業(yè)論文作者：肖瓊 房云�！⌒焯N 田鏵 張立平 田興松
【摘要】 目的：探索分離、培養鼠主動(dòng)脈內皮細胞的有效方法。方法：將鼠主動(dòng)脈內膜翻向外，結扎兩端，置于50 mL培養瓶中培養、傳代，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色。結果：培養6～8 d 時(shí)有少量細胞自主動(dòng)脈遷移出并貼壁生長(cháng)；12～14 d 時(shí)貼壁細胞覆蓋大部分培養瓶面，約80%的細胞匯合成單層；傳代細胞生長(cháng)旺盛；細胞匯合后呈現典型的“鵝卵石”樣內皮細胞特征，內皮細胞標志物Ⅷ因子相關(guān)抗原表達陽(yáng)性；未見(jiàn)雜細胞。結論：此方法無(wú)損傷、不需要酶消化，能比較容易的獲得高純度大鼠原代主動(dòng)脈內皮細胞，適用于細小血管內皮細胞的分離與培養。
【關(guān)鍵詞】 主動(dòng)脈·體外培養·內皮細胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
內皮細胞是研究心血管、炎癥、腫瘤等疾病最常用的工具。目前，對臍靜脈等較大血管原代內皮細胞的分離與培養1般采用酶消化法，技術(shù)已經(jīng)成熟。但對于大鼠等小動(dòng)物血管而言，由于管徑細小，操作難度大，其內皮細胞的分離與培養1直存在產(chǎn)量少、易混入雜細胞等問(wèn)題 ［1］。本研究經(jīng)過(guò)反復實(shí)驗，建立了1種有效獲取高純度、高數量大鼠原代血管內皮細胞的分離與培養方法。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗材料 4周齡Wistar 大鼠10只，均為雌性，體質(zhì)量140～160 g（購自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心），縫衣針，手術(shù)縫合線(xiàn)，胎牛血清（HyClone，購自美國），DMEM/F12培養基（Gibco，購自美國）。
1.2 培養方法
1.2.1 大鼠主動(dòng)脈的原代培養 取Wistar 大鼠1只，無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔和胸腔。截取主動(dòng)脈約3 cm,放入含有青霉素105 U/L、鏈霉素100 mg/L的D-Hanks液中，用吸管將動(dòng)脈管腔殘留的血液沖洗干凈�？p衣針去尖,牽引手術(shù)縫合線(xiàn)穿過(guò)主動(dòng)脈管腔，縫合線(xiàn)的遠端就近結扎動(dòng)脈的1端，血管鉗牽引縫合線(xiàn)近端，同時(shí)用鑷子輕輕反向下滑動(dòng)脈，使主動(dòng)脈內膜翻出，折入縫扎動(dòng)脈的另1端，此時(shí)翻過(guò)來(lái)的動(dòng)脈兩端被完全折入封閉。將動(dòng)脈置于50 mL培養瓶中，加入含有20%胎牛血清的培養液，液體僅遮蓋主動(dòng)脈即可，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養，3 d 換液1次。
1.2.２ 細胞傳代培養 原代培養約12 ～14 d，遷出生長(cháng)的細胞覆蓋培養瓶面積的2/3以上，約80 %的細胞匯合即可傳代。取出主動(dòng)脈，用D-Hanks液沖洗培養瓶2次，常規消化、吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培養液適量，制成細胞懸液，依照細胞的量按1：1或1：2傳代培養，3 d換液1次。另9只大鼠以同樣步驟重復上述實(shí)驗。
1.3 免疫細胞化學(xué)鑒定 在24孔培養板內放置無(wú)菌蓋玻片，每孔種植1 mL 含有104個(gè)細胞的懸液，待細胞生長(cháng)至接近匯合時(shí),取出蓋玻片，室溫下4%的多聚甲醛固定10 min,常規SABC法顯示血管內皮細胞標志物Ⅷ因子相關(guān)抗原（vWF）。
1.4 細胞純度分析 取6次培養的第2代主動(dòng)脈內皮細胞，vWF免疫細胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個(gè)視野計數細胞，計算細胞陽(yáng)性表達率（細胞陽(yáng)性表達率=陽(yáng)性細胞數/細胞總數）。
2 結果
2.1 形態(tài)學(xué) 原代培養6～8 d，在動(dòng)脈附近可見(jiàn)少量的細胞遷出并貼壁生長(cháng)，細胞呈短梭形或多角形。培養至12 ～14 d，遷移出生長(cháng)的細胞覆蓋培養瓶面積的2/3以上，密度不勻，其中約80 %的細胞匯合成單層，呈現內皮細胞典型的“鵝卵石”樣特征（圖1）。傳代培養的細胞0.5 h開(kāi)始貼壁，2 h后約90 %的細胞貼壁，4 ～5 d時(shí)細胞匯合成單層。培養至9代時(shí)，細胞質(zhì)內有空泡出現，同時(shí)出現胞體瘦小，細胞呈現老化狀態(tài)。
2.2 免疫細胞化學(xué)染色 vWF免疫細胞化學(xué)染色，細胞質(zhì)呈現棕黃色陽(yáng)性反應。每張蓋玻片100倍鏡下隨機選10個(gè)視野進(jìn)行觀(guān)察，均未見(jiàn)染色陰性表達細胞（圖2）。
2.3 細胞純度分析 vWF免疫細胞化學(xué)染色后，每張蓋玻片400倍鏡下隨機選5個(gè)視野計數細胞，所見(jiàn)細胞均為陽(yáng)性染色細胞，陽(yáng)性表達率為100%，即獲取的內皮細胞純度為100%。
重復實(shí)驗10次，均獲得同樣結果。
[NextPage]
3 討論
血管內皮細胞的原代分離與培養是研究其分子生物學(xué)特性及相關(guān)疾病的重要前提，大鼠是最常用的實(shí)驗動(dòng)物之1。長(cháng)期以來(lái)，由于大鼠血管細小，操作難度大，其血管內皮細胞的分離與培養尚缺乏理想的手段。鼠主動(dòng)脈內皮細胞多采用酶消化法［2-3］和植塊法［4－6］。
酶消化法可以在相對短的時(shí)間內獲取細胞。大鼠主動(dòng)脈較細，本實(shí)驗發(fā)現150 g的大鼠主動(dòng)脈管徑約2 mm，其分支非常細且不易結扎，灌注的酶消化液容易經(jīng)其分支滲漏至管外，使外膜也被消化，導致其他細胞混入；細胞產(chǎn)量亦較低，且大多需同時(shí)獲取多條動(dòng)脈，操作復雜；有時(shí)因酶的活性改變而使消化時(shí)間難以掌控,不僅影響內皮細胞的分離和提取，亦可直接影響內皮細胞的活力［7］。
組織塊移植培養法操作簡(jiǎn)單，對細胞活力無(wú)損傷，缺點(diǎn)為長(cháng)出的細胞成分比較復雜，內皮細胞純度低［8］，常伴有成纖維細胞污染。由于成纖維細胞生長(cháng)迅速，最終過(guò)度生長(cháng)甚至覆蓋內皮細胞而影響內皮細胞增殖。有學(xué)者將大鼠主動(dòng)脈外膜做瞬間熱處理后再進(jìn)行植塊培養，提高獲取內皮細胞的純度至67.8%［6］。
本研究采取將大鼠主動(dòng)脈內膜翻向外、兩端內折結扎后直接培養的方法獲取血管內皮細胞。結果發(fā)現，血管內皮細胞呈現接觸性抑制的“鵝卵石”樣特征，其標志物vWF表達陽(yáng)性，未發(fā)現雜細胞等，提示獲得了數量可觀(guān)的單1的血管內皮細胞。本研究采用10只大鼠重復實(shí)驗，均獲得了同樣的結果，證明該方法具有可重復性。此方法的優(yōu)勢在于：1）獲取的血管內皮細胞純度高、數量多。由于血管兩端內折結扎，整段血管僅內膜接觸培養瓶，外膜面的細胞不易遷出，經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色未發(fā)現vWF陰性細胞，有效避免了血管壁其他細胞的混入。1只大鼠的主動(dòng)脈即可產(chǎn)出5×105個(gè)原代內皮細胞，細胞產(chǎn)出量相對較高，經(jīng)傳代培養，可以滿(mǎn)足基本實(shí)驗需要。2）對細胞無(wú)損傷。內皮細胞是1種比較嬌嫩的細胞。本實(shí)驗方法無(wú)需酶消化，避免了酶消化過(guò)程中對細胞的破壞作用，同時(shí)節省了酶灌注和消化時(shí)間，操作時(shí)間短，有效保護了內皮細胞的活力。3）降低實(shí)驗費用。胰酶廉價(jià)、活性強，但對細胞的損傷大，因此多選用對細胞損傷少的膠原酶,但其價(jià)格昂貴。本實(shí)驗不需要酶消化，降低了實(shí)驗費用。4）操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快捷，減少了細胞被污染的幾率。
此方法解決了鼠主動(dòng)脈內皮細胞難獲取的問(wèn)題，也適用于其他較大動(dòng)物細小血管內皮細胞的分離與培養，為進(jìn)1步研究其內皮細胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)疾病提供了良好平臺。
【參考文獻】
［1］ Cole OF, Fan TP, Lewis GP. Isolation, characterization, growth and culture of endothelial cells from the rat aorta[J]. Cell Biol Int Rep, 1986, 10（6）:399-405.
［2］ kobayashi M, inoue K, Warabi E, et al. A simple method of isolating mouse aortic endothelial cells[J]. J Atheroscler Thromb, 2005, 12（3）:138-142.
［3］ Battle T, Arnal JF, Challah M, et a1. Selective isolation of rat aortic wall layers and their cell types in culture-application to converting enzyme activity measurement [J]. Tissue Cell, 1994, 26（6）:943-955.
［4］ Kreisel D, Krupnick AS, Szeto WY, et a1. A simple method for culturing mouse vascular endothelium[J]. J Immunol Methods, 2001, 254（1-2）:31-45.
［5］ Lincoln DW, Larsen AM, Phillips PG, et al. Isolation of murine aortic endothelial cells In culture and the effects of sex steroids on their growth[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2003, 39（3-4）:140-145.
［6］ 林哲絢，羅文鴻，李慧．瞬間熱處理大鼠主動(dòng)脈內皮細胞分離培養法[J]．解剖學(xué)雜志，2004，27（5）：571-573．
［7］ 李淑香，王佐周，邱雪杉．酶消化對培養臍靜脈內皮細胞的影響[J]．解剖科學(xué)進(jìn)展，2000，6（2）：186．
［8］ Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A（6）:394-399.
【簡(jiǎn)便有效分離培養大鼠主動(dòng)脈內皮細胞的一種新方法】相關(guān)文章：
一種NAND FLASH自啟動(dòng)的新方法03-30
簡(jiǎn)述梨黑星病菌的分離培養和基質(zhì)研究03-17
一種提取辣椒紅色素的新方法01-01
外周血單個(gè)核細胞中肺炎衣原體的分離、培養及傳代03-08