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探究人臍帶間充質(zhì)干細胞生物特性比較論文
引言 Introduction
間充質(zhì)干細胞是一類(lèi)起源于中胚層的非造血干細胞，具有多向分化的潛能，能夠為細胞治療提供理想的種子細胞，同時(shí)也能作為基因治療的載體細胞，目前已從骨髓、胎盤(pán)、脂肪、臍血、臍帶、滑膜等組織器官中分離出間充質(zhì)干細胞。體外培養的間充質(zhì)干細胞形態(tài)均一，平行生長(cháng)或漩渦狀生長(cháng)，能夠表達多種表面抗原，如高表達間質(zhì)細胞標志(CD44、CD90、CD105)，不表達造血干細胞標志(CD34、CD45、CD14)、內皮細胞標志(CD31、CD33)及人白細胞抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)等。在特定條件下間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞、神經(jīng)細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞及肝細胞等。相比其他間充質(zhì)干細胞，本實(shí)驗選用的人臍帶間充質(zhì)干細胞具有種子細胞的很多優(yōu)良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無(wú)致瘤性等，且來(lái)源充足，無(wú)倫理問(wèn)題�，F階段用于分離間充質(zhì)干細胞的方法主要有以下幾種：貼壁組織塊法、流式細胞儀分選法、膠原酶消化法及其改進(jìn)方法等。每種方法各有利弊，貼壁組織塊法原代培養時(shí)間較長(cháng)，液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長(cháng)出細胞的能力，減少了細胞數量，但細胞活性保持良好。流式細胞儀分選法雖然所獲得的細胞純度較高，但實(shí)驗成本較大，亦難獲得足夠的細胞數量。普通膠原酶消化法費用較高，雖然可在短時(shí)間內獲得細胞，但常溫中消化時(shí)間長(cháng)可能損傷細胞，致使細胞不易貼壁，不易傳代;消化時(shí)間短液體較黏稠，難以離心獲得足夠量細胞。胰酶冷消化法曾用于培養乳鼠心肌細胞，與溫胰蛋白酶消化法比較，胰酶冷消化法所需實(shí)驗條件簡(jiǎn)單，因為不需攪拌和多次酶消化、清洗的煩瑣過(guò)程，胰蛋白酶用量少，節約大量的人力物力，而且冷消化相對細胞活性損傷較輕。本實(shí)驗首次采取胰酶冷消化法分離臍帶間充質(zhì)干細胞[23]，從細胞形態(tài)、生長(cháng)曲線(xiàn)、細胞表面標記物及誘導分化能力4個(gè)方面與傳統組織塊法比較，為不同需求的科研工作者獲得較多的臍帶間充質(zhì)干細胞、更完整的細胞結構及其功能以滿(mǎn)足實(shí)驗要求并能達到更節約人力、物力提供一些資料。
1 材料和方法 Materials and methods
設計：對比觀(guān)察細胞學(xué)實(shí)驗。
時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗于2013年6月至2014年3月在新疆醫科大學(xué)干細胞研究室完成。
材料：足月健康新生兒臍帶組織取自新疆醫科大學(xué)第五附屬醫院婦產(chǎn)科，產(chǎn)婦及家屬均知情同意，采集后裝于盛有無(wú)菌生理鹽水的50 mL離心管中，4 h內處理。
實(shí)驗方法：
臍帶間充質(zhì)干細胞的原代培養：胰酶冷消化法：取足月健康新生兒臍帶組織，剔除組織中的血管，用PBS反復沖洗去除血跡，剪碎至大小約1 mm3，放入50 mL離心管中，加入PBS離心(1 200 r/min)5 min，洗滌3遍，之后取離心后的組織塊放入培養皿中并加入稀釋后的胰酶(PBS與胰酶同比例混合)10 mL，用封口膜封死培養皿邊緣，放入4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天取出培養皿中的組織于50 mL離心管中，放入37 ℃水浴箱中15 min，之后加入L-DMEM用巴氏管充分吹打，靜置1 min待組織塊沉底后吸取上清液于15 mL離心管中。上述步驟重復操作2遍，盡量收集上清液，加入15 mL離心管離心(1 200 r/min)10 min，去除上清液加入含體積分數為20%胎牛血清培養液�；靹蚝蠹尤肱囵B皿中，放入37 ℃、體積分數為5%CO2及飽和濕度條件下培養，每3 d換液1次。培養14 d左右，當細胞達到大部分融合時(shí)，用胰酶消化傳代，并將組織轉移到一個(gè)新的培養皿中，按上述方法繼續培養。組織塊培養法：取足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS洗滌數遍，去除殘留血跡。把臍帶剪切成4.0 cm左右的片段并剔除血管(1條臍靜脈，2條臍動(dòng)脈)，之后將其剪成大小約1 mm3的組織塊，然后平攤置于55 mm培養皿中并加入2 mL胎牛血清加以固定。2 h后，按比例加入含有青鏈霉素、谷氨酰胺、維生素C及碳酸氫鈉的L-DMEM培養基約8 mL，放置在37 ℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養。每隔3 d半換液1次。觀(guān)察貼壁組織周?chē)募毎L(cháng)情況，當細胞達到80%-90%融合度時(shí)，用胰酶消化傳代，并將組織轉移到一個(gè)新的培養皿中，按上述方法繼續培養。
臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性：細胞形態(tài)：兩種方法培養的原代細胞通過(guò)普通倒置顯微鏡觀(guān)察其形態(tài)變化。生長(cháng)曲線(xiàn)：取上述兩組第2代臍帶間充質(zhì)干細胞以每孔5×103/cm2的濃度接種于24孔板中。采用胰酶消化錐蟲(chóng)藍染色法，每日取4孔計數細胞，繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)，細胞達到生長(cháng)抑制時(shí)停止實(shí)驗。流式細胞儀檢測細胞表面標記特征：胰蛋白酶消化第3代臍帶間充質(zhì)干細胞，1 200 r/min離心5 min，細胞重懸。調整細胞濃度為1×106 L-1，與抗CD29，CD34，CD45，CD105單克隆抗體室溫反應30 min，PBS洗滌2次后，與FITC或PE標記的二抗避光作用30 min，將洗滌后的細胞重懸于PBS中，待測。誘導臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞：取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞，置于誘導培養基(含2%B27、20 μg/L堿性成纖維細胞生長(cháng)因子、20 μg/L表皮生長(cháng)因子的DMEM/F12培養基)中培養，倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞的形態(tài)變化。取誘導第3天的臍帶間充質(zhì)干細胞，行熒光免疫化學(xué)檢測，細胞爬片在室溫下用40 g/L多聚甲醛固定，經(jīng)PBS預清洗，血清封閉，滴加兔抗人神經(jīng)巢蛋白抗體(1∶400)，置濕盒中4 ℃下過(guò)夜。加入Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG抗體(1∶200)，37 ℃下孵育0.5 h。以PBS作為陰性對照。
主要觀(guān)察指標：①兩種方法培養的原代臍帶間充質(zhì)干細胞最早出現時(shí)間及培養周期。②兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)。③兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)。④兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞表面標記特征。⑤兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞多向分化的潛能。
統計學(xué)分析：用SPSS 17.0統計學(xué)軟件處理，做t 檢驗，P < 0.05為差異有顯著(zhù)性意義。
2 結果 Results
2.1 兩種方法培養的原代臍帶間充質(zhì)干細胞最早出現時(shí)間及培養周期
使用上述兩種方法均可獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞，組織塊法在種植后第5-7天才見(jiàn)到細胞從組織塊爬出，最早觀(guān)察細胞貼壁時(shí)間為(5.80±0.84) d，而胰酶冷消化法在消化種植后第2，3天就可見(jiàn)到細胞貼壁生長(cháng)，最早觀(guān)察細胞貼壁時(shí)間為(2.60±0.55) d，差異有顯著(zhù)性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的原代細胞達到90%-95%融合的時(shí)間差異無(wú)顯著(zhù)性意義(P > 0.05)，組織塊法為(14.4±1.67) d，胰酶冷消化法為(14.6±0.90) d。
2.2 兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀(guān)察及生長(cháng)情況
胰酶冷消化法培養兩三天就可見(jiàn)單個(gè)貼壁細胞，呈圓形或短梭形，培養10 d左右，細胞形態(tài)逐漸伸展開(kāi)來(lái)，大體呈長(cháng)梭形，但少數細胞邊緣不光滑，為多角形，不規則，細胞的體積較大，培養2周之后，細胞已逐漸形成漩渦狀的集落，且逐漸變大，細胞增多，即可傳代。傳代后的細胞生長(cháng)速度明顯增快，數量增多，四五天即可傳代1次。組織塊法培養5 d左右亦可觀(guān)察到個(gè)別細胞沿組織塊邊緣爬出，呈短梭形、纖細;隨后細胞數量增多，慢慢向外擴長(cháng)，形態(tài)類(lèi)似成纖維細胞，并逐漸形成漩渦狀的集落，培養13-16 d，可見(jiàn)細胞集落逐漸變大，細胞增多，即可傳代。
2.3 第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)
兩組細胞的增殖曲線(xiàn)近似“S”型，細胞種植后第一二天處于潛伏期，從第3天起細胞開(kāi)始進(jìn)入對數增殖期，于第8天左右進(jìn)入平臺期;組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著(zhù)快于胰酶冷消化法，在進(jìn)入對數生長(cháng)期后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細胞數量差異有顯著(zhù)性意義(P < 0.05)。
2.4 兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞表面抗原檢測
為了明確臍帶來(lái)源貼壁生長(cháng)細胞是否與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相同的抗原標志表達，取上述第3代臍帶間充質(zhì)干細胞樣細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，結果顯示，上述細胞不表達CD34，CD45，而表達CD29、CD105，即表達了骨髓間充質(zhì)干細胞的常見(jiàn)抗原標志。
2.5 兩種方法培養的臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞多向分化的潛能
兩種方法培養出來(lái)的第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞加入誘導液后第2天均可看到部分細胞聚集成團漂浮于誘導液當中，呈橢圓形或圓形，隨著(zhù)誘導時(shí)間增長(cháng)，漂浮的神經(jīng)球樣細胞越來(lái)越多，且越來(lái)越大，免疫熒光顯示神經(jīng)球樣細胞表達神經(jīng)干細胞特征性標志物nestin陽(yáng)性。
3 討論 Discussion
臍帶是聯(lián)系胎兒與胎盤(pán)的一種管狀結構，在胎兒正常分娩時(shí)被當作廢棄物丟棄。故利用臍帶來(lái)分離擴增間充質(zhì)干細胞屬于變廢為寶，幾乎不涉及倫理道德問(wèn)題，易于收集，不易污染，可以在短時(shí)間內獲得足夠數量的細胞;其次，臍帶間充質(zhì)干細胞比較原始，分化、增殖分化能力強，生物活性穩定，而骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓內含量較少且增殖能力隨著(zhù)年齡的增長(cháng)而顯著(zhù)下降，故易受到供者年齡的限制。Weiss等也通過(guò)CFU-F培養法檢測顯示臍帶中間充質(zhì)干細胞含量明顯多于骨髓液。因此臍帶間充質(zhì)干細胞以其獨特的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為干細胞中最具有應用前景的種子細胞。
本實(shí)驗使用上述兩種方法均可獲得臍帶間充質(zhì)干細胞，組織塊法在種植后第5-7天才見(jiàn)到細胞從組織塊爬出，而胰酶冷消化法在消化種植后兩三天就可見(jiàn)到細胞貼壁生長(cháng)，差異有顯著(zhù)性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的細胞達到90%-95%融合的時(shí)間差異無(wú)顯著(zhù)性意義(P > 0.05)，鏡下可見(jiàn)細胞均為貼壁生長(cháng)，呈成纖維細胞樣，但胰酶冷消化法培養的少數細胞呈多角形，不規則，細胞的體積較組織塊法大。組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著(zhù)快于胰酶冷消化法，在進(jìn)入對數生長(cháng)期后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細胞數量差異有顯著(zhù)性意義(P < 0.05)，提示冷消化法對原代的臍帶間充質(zhì)干細胞有損害作用。兩種方法獲得的細胞經(jīng)3代以上培養，均呈現長(cháng)梭形貼壁形態(tài)，與骨髓間充質(zhì)干細胞為金標準一樣，具有與其相同的表面標志，如表達CD29、CD105，不表達CD34、CD45，具有間充質(zhì)干細胞的特性。臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導后呈現神經(jīng)球樣形態(tài)，漂浮于誘導液當中，表達神經(jīng)干細胞特異性標志——nestin蛋白;進(jìn)一步將這些細胞球分離成單細胞懸液，繼續傳代培養，發(fā)現單個(gè)的細胞又很快變成類(lèi)似原代培養時(shí)出現的島嶼狀細胞球，充分顯示了神經(jīng)干細胞有別于一般神經(jīng)細胞的增殖特性，說(shuō)明人臍帶間充質(zhì)干細胞在特定的培養液中具備形成神經(jīng)干細胞的潛力和特性;實(shí)驗中所采用的培養條件可以保證神經(jīng)干細胞的生成與存活環(huán)境，有人把神經(jīng)球繼續誘導可以表達NSE、GFAP、NF-M、S100、Tubulin等神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)特異性表達標志物，為將來(lái)以誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞成神經(jīng)干細胞作為種子細胞進(jìn)行體內移植治療脊髓損傷提供了實(shí)驗依據。
實(shí)驗結果顯示：胰酶冷消化法與組織塊法均能培養出人臍帶間充質(zhì)干細胞，具有相同的表面標志及誘導成神經(jīng)干細胞的能力。組織塊法的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，無(wú)需放入4 ℃冰箱過(guò)夜，操作時(shí)間短，而且原代培養時(shí)間也與酶消化法無(wú)明顯差異，細胞形態(tài)保持良好的長(cháng)梭形，此法對細胞無(wú)明顯損害，細胞活性較冷消化法強。缺點(diǎn)：液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長(cháng)出細胞的能力，減少了細胞數量。胰酶冷消化法通過(guò)研究?jì)H原代細胞爬出時(shí)間較組織塊法早，其他無(wú)明顯優(yōu)勢，故胰酶冷消化法雖然可以同樣培養出人臍帶間充質(zhì)干細胞，但并沒(méi)有想象中有那么多優(yōu)點(diǎn)，相對而言操作變得煩瑣且時(shí)間長(cháng)，細胞形態(tài)也受到損害。故對于培養人臍帶間充干細胞，組織塊法要優(yōu)于胰酶冷消化法。
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