- 相關(guān)推薦
響應面法優(yōu)化耐有機溶劑脂肪酶營(yíng)養條件
摘要：本文以響應面法對蠟狀芽孢桿菌SWWL6 液體發(fā)酵產(chǎn)酶的營(yíng)養條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單因素實(shí)驗確定發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源及無(wú)機鹽分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4? 7H20 和NaCl。采用部分因子分析法研究初始發(fā)酵培養基各種組分對產(chǎn)酶的影響程度，發(fā)現酵母膏、NH4NO3 的質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響顯著(zhù)。通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗逼近最大響應區域。中心組合設計和響應面分析法確定最優(yōu)培養基組成為酵母膏0.64%、NH4NO3 0.384%、可溶性淀粉1%、MgSO4? 7H20 0.1%，NaCl 0.25%，甲苯20%。優(yōu)化后相對酶活比優(yōu)化前的提高了3.48 倍。
關(guān)鍵詞：耐有機溶劑；脂肪酶；響應面法；蠟狀芽孢桿菌
0 引言
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類(lèi)重要的甘油酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。在特定的非水相系統中，還可催化水解反應的逆反應，以及酯化合成和轉酯反應。從催化特性來(lái)看，脂肪酶具有化學(xué)選擇性、高度的立體異構專(zhuān)一性、不需輔酶、高效、反應條件溫和、無(wú)毒、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨著(zhù)非水相酶學(xué)的不斷深入，脂肪酶的應用已超出了水相中水解反應的范圍，被廣泛應用于有機相中酯的合成、手性化合物的拆分、高聚物的合成、肽合成、生物柴油的合成等方面，具有廣闊的應用前景。有機合成大多數是在有機介質(zhì)中進(jìn)行的，而有機溶劑則易引起蛋白質(zhì)的變性，使酶失活，因此限制了酶在有機合成中的應用[1]。如果一種脂肪酶能在高濃度的有機溶劑中具有穩定性，就能很好的解決催化環(huán)境受限的問(wèn)題，使酶的催化反應更容易化，同時(shí)降低了酶的生產(chǎn)成本。
因此耐有機溶劑脂肪酶的研究具有非常重要的意義。目前，關(guān)于耐有機溶劑脂肪酶的研究多見(jiàn)于國外報道，日本的Ogino H 等人篩選到有機溶劑耐受菌Psudomonas aeruginosaLST-03[2]。國內鮮見(jiàn)報道，尤其是關(guān)于蠟狀芽孢桿菌脂肪酶還沒(méi)有見(jiàn)到報道。
隨著(zhù)計算方法的完善和微機應用的普及，響應面方法已被成功應用于科學(xué)研究的許多領(lǐng)域[3、4]。它是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法[5]，采用更為合理的試驗設計，能以最經(jīng)濟的方式對試驗進(jìn)行全面研究。該方法已被廣泛地用于同時(shí)存在多因素影響的實(shí)驗優(yōu)化上。本文結合了單因素實(shí)驗、部分因子實(shí)驗、響應面法對Bacillus cereus SWWL6 發(fā)酵培養基進(jìn)行了優(yōu)化，從而提高脂肪酶的產(chǎn)量，為耐有機溶劑脂肪酶的進(jìn)一步分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及應用研究奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗菌株蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 吉林農業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室保藏菌株。
1.2 培養基及培養條件斜面培養基：橄欖油0.1%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0種子培養基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，pH 7.0發(fā)酵培養基：橄欖油1%，酵母浸膏0.5%，MgSO4·7H20 0.1%，NaCl 0.25%,甲苯20%，pH 7.0將斜面活化后的菌種接至裝有50mL 種子培養基的250mL 三角瓶，30℃，150r/min 培養24h，制得種子液。以5％接種量轉接到裝有40 mL 發(fā)酵液的250 mL 三角瓶中，30℃，150r/min 條件下培養48h。發(fā)酵液于8000r／min 離心15min，取上清液測定酶活力[6、7]。
1.3 酶活力測定方法脂肪酶的活力測定采用分光光度計法[8]。在刻度試管中加入1mM p-NPP 溶液lmL 和50mM Tris-HCL 緩沖液(pH8.0)lmL，兩者充分混勻后于38℃水浴中保溫5min，向測定管加入適當稀釋的待測酶液0.1mL，以加熱滅活的待測酶液作為空白對照,反應15min 后快速取出，定容至7.5mL 于分光光度計4l0nm 下測定酶催化產(chǎn)生的對硝基苯酚（pNP）的吸光值。脂肪酶 1 個(gè)酶活力單位的定義(U)：在上述條件下，每分鐘水解p-NPP 產(chǎn)生1μmol 對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
1.4 單因素實(shí)驗
1.4.1 最適碳源篩選分別以 1%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、橄欖油+葡萄糖（3：2）代替初始發(fā)酵培養基的碳源，其他成分不變，配制成不同碳源的產(chǎn)酶培養基，發(fā)酵后進(jìn)行酶活測定。以初始培養基中橄欖油的酶活為100%[10]。
1.4.2 最適氮源篩選以可溶性淀粉作為碳源，0.5%的酵母膏、酵母膏+蛋白胨（3：2）、蛋白胨、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4 七種有機氮源和無(wú)機氮源進(jìn)行最佳氮源的篩選。以初始培養基中酵母膏的酶活作為100%。
1.4.3 最適無(wú)機鹽的篩選以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復合氮源，分別以0.5%的K2HPO4、0.1%的MgSO4·7H20、0.25%和0.5%的NaCl 作為無(wú)機鹽進(jìn)行篩選。以K2HPO4 的酶活為100%。
1.5 實(shí)驗設計
1.5.1 部分因子實(shí)驗設計(Fractional Factorial Design, FFD)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 菌株產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養基成分主要有可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯，采用6 因素2 水平的1/8 部分因子實(shí)驗設計，實(shí)驗次數為8。擬合出線(xiàn)性方程：
Y = a0 + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X4 + a5X5 + a6X6 (1)式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6 分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯的質(zhì)量濃度(g/100mL)，Y 為相對酶活力(%)，a0、a1、a2、a3、a4、a5、a6 為方程系數。
1.5.2 最陡爬坡實(shí)驗設計根據部分因子實(shí)驗的實(shí)驗結果,以擬合的一階模型回歸系數的符號和大小來(lái)設計顯著(zhù)因素的最陡爬坡方向及步長(cháng)，通過(guò)使主要因素同時(shí)朝響應值增大的方向變化, 進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗設計，找出峰值, 從而逼近最大響應區域。
1.5.3 中心組合實(shí)驗設計(Central Composite Design,CCD)[9]
以相對酶活作為響應值，采用2 因素5 水平的中心組合設計對影響SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)酶的2 個(gè)主要影響因素(酵母膏、NH4NO3)進(jìn)行響應面優(yōu)化，5 水平的設計,其中中心點(diǎn)取最陡爬坡實(shí)驗最大響應值時(shí)的水平值。
擬合出一個(gè)二次多項式方程。該方程為描述響應變量與自變量的經(jīng)驗模型。對于2 因子系統，模型可述為：
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b11X1X1+ b12X1X2 + b22X2X2 （2）式中： X1、X2 為部分因子實(shí)驗確定對響應值影響顯著(zhù)的2 種培養基組分的質(zhì)量濃度(g/100mL)，Y 為預測響應值，即相對酶活(%)： b0、b1、b2、b11、b12、b22 為方程系數。用MINITAB 軟件對實(shí)驗進(jìn)行回歸分析，其中回歸系數的顯著(zhù)性用t 檢驗，數學(xué)模型方程的顯著(zhù)性用F(Fischer)檢驗評價(jià)，方程的擬合性由確定系數R2 確定。
1.6 模型驗證對該多元函數進(jìn)行簡(jiǎn)單的性狀分析便可確定出其極值點(diǎn)以及取得極值的相應的自變量的取值。再按照計算所得到的參數進(jìn)行實(shí)驗，以驗證模型的可靠性，并確定最后的優(yōu)化結果。
2 結果與討論
2.1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響按照 1.4.1 的方法進(jìn)行碳源篩選，結果如圖1 所示：由圖 1 可知，在供試的六種碳源中，產(chǎn)生耐有機溶劑脂肪酶相對酶活力依次為可溶性淀粉＞橄欖油+葡萄糖＞橄欖油＞麥芽糖＞葡萄糖＞蔗糖�？扇苄缘矸鄣男Ч黠@優(yōu)于其它單一組分的碳源，故選可溶性淀粉為發(fā)酵最適碳源。
2.2 最佳氮源的選擇按照 1.4.2 的方法進(jìn)行最佳氮源的選擇，實(shí)驗結果如所示：顯示的結果明，有機氮源中以酵母膏的產(chǎn)酶效果最佳，無(wú)機氮源以NH4NO3 產(chǎn)酶最佳，大多數微生物更傾向利用有機和無(wú)機復合氮源，對酵母膏和NH4NO3 組成的復合氮源進(jìn)行了考察，效果優(yōu)于單一的無(wú)機或有機氮源，因此選用酵母膏和NH4NO3 組成復合氮源。
2.3 無(wú)機鹽的選擇按照 1.4.3 的方法進(jìn)行無(wú)機鹽的選擇，實(shí)驗結果如所示：無(wú)機鹽組分中，0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，Sharma[11]等報道,往培養基中添加Mg2+有利于大多數微生物產(chǎn)脂肪酶，而大量的Na+對產(chǎn)酶有抑制作用，因此，選用0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 復合物為無(wú)機鹽。
故確定以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復合氮源，0.1%的MgSO4·7H20 和0.25%的NaCl 為無(wú)機鹽進(jìn)行下一步的優(yōu)化。
2.4 部分因子實(shí)驗篩選液體發(fā)酵的顯著(zhù)因素應用部分因子實(shí)驗對培養基的組成進(jìn)行篩選，試驗設計及實(shí)驗結果見(jiàn)1。為了統一實(shí)驗結果，以對初始培養基的相對酶活作為響應值。各因素水平編碼值及回歸分析見(jiàn)。
R2=99.62%結果顯示，培養基成分中對SWWL6 產(chǎn)酶影響較顯著(zhù)是酵母膏、NH4NO3（置信度≥99%）。
且兩者對產(chǎn)酶均呈現正效應。該方程的決定系數R 為99.62%明回歸方程擬合良好。由顯著(zhù)因子效應可以看出，在原始培養基基礎上逐漸增加酵母膏、NH4NO3 的濃度對產(chǎn)酶有有利。
其他因素對產(chǎn)酶影響不顯著(zhù)，維持在低水平。所以選擇酵母膏、NH4NO3 這兩個(gè)因素作為下一步研究對象。
2.5 最陡爬坡實(shí)驗針對酵母膏、NH4NO3 質(zhì)量濃度進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗。實(shí)驗設計及實(shí)驗結果如所示。由結果可知，最大產(chǎn)酶區在第4 次試驗附近，故以實(shí)驗4 的條件為響應面實(shí)驗因素水平的中心點(diǎn)。
2.6 中心組合設計應用 MINITAB 軟件設計中心組合實(shí)驗，采用22 全因子中心組合實(shí)驗，共13 次試驗。中心組合實(shí)驗因素水平見(jiàn)4, 2 因素5 水平的響應面中心組合實(shí)驗設計及實(shí)驗結果如5所示。
2.6.1 響應面回歸模型的建立及置信度分析由 MINITAB 軟件擬合得到多項式回歸模型為：Y=344.7-24.4X1 -16.5X2-55.5X1*X1-14.2X1*X2-43.1X2*X2 回歸方程系數顯著(zhù)性分析如6 所示,模型方差分析見(jiàn)。
R2=98.5%由可知回歸方程的一次項、平方項的系數和均方差較大，交互項的系數和均方差較小，說(shuō)明兩個(gè)因素間交互效應較小。結果明，在α=0. 0001 水平上，該模型失擬不顯著(zhù)，回歸高度顯著(zhù)。決定系數R2 為98.5%，說(shuō)明模型能解釋98.5%脂肪酶產(chǎn)量的變化,回歸擬合程度較好。該方法為SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶提供了一個(gè)合適的模型，因此可用上述模型代替真實(shí)試驗點(diǎn)對脂肪酶發(fā)酵進(jìn)行分析和預測。
2.6.2 響應因子水平的優(yōu)化圖 4 繪制了中心組合響應面，以酵母膏和硝酸銨的水平作為平面坐標，以脂肪酶相對酶活作為響應值。
從響應面的立體圖可知，回歸模型存在最大值，最大值的穩定點(diǎn)是在（-0.2028，-0.1585），對應的X1、X2 實(shí)際取值為（0.640，0.384），Y 的最大估計值為348.44。即當酵母膏和NH4NO3的濃度為0.640%和0.384%時(shí)，模型預測的最大相對酶活為348.44%此條件下進(jìn)行重復搖瓶發(fā)酵試驗，獲得實(shí)際平均產(chǎn)酶活力為347.98%。預測值與實(shí)際值之間的良好擬合性證實(shí)該模型的有效性。
3 結論
本文應用部分因子設計和響應面法對Bacillus cereus SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)酶營(yíng)養條件進(jìn)行快速、有效優(yōu)化。優(yōu)化后培養基的組成為：淀粉1%，酵母膏0.64%，NH4NO30.384%，MgSO4·7H200.1%，NaCl 0.25%。在優(yōu)化條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h 產(chǎn)脂肪酶是優(yōu)化前的3.48 倍。
中國碩士論文網(wǎng)提供大量免費碩士畢業(yè)論文,如有業(yè)務(wù)需求請咨詢(xún)網(wǎng)站客服人員！
[參考文獻] (References)
[1] 彭仁、魏東芝.耐有機溶劑脂肪酶的研究進(jìn)展[M].生物技術(shù)，2012 18（5）：92-95
[2] Ogino H,Miyamoto K,Ishkawa H.Organic-solvent-tolerant bacterium which secretes Oeganic-solvent-stablelipolytic enzame[J].Appl.Environ.Microbiol.1994,60(10)：3884-3886.
[3] Sen R, Swaminathan T S. Application of response sur-face methodology to evaluate the optimumenvironmentalconditions for the enhanced production of surfactin[J].Appl Microbiol Biotech, 1997,47:358-363.
[4] Kwak J S. Application of Taguchi and response surface methodologies for geometric error in surface grindingpro-cess[J]. International Journal of Machine Tools & Man-ufacture, 2005,45:327-334.
[5] 李孱,白景華,蔡昭鈴,等.細菌素發(fā)酵培養基的優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)初步分析[J].生物工程學(xué)報,2001,17(2):187-192.
[6] 陳魁.試驗設計與分析[M].北京:清華大學(xué)出版社, 1996:94-180.
[7] Rohit S,Uttam C B.Production，purification,characterization，and applications of lipases[J].BiotechnologyAdvances,2001,23(19):627-662
[8] 江惠芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進(jìn)[J].化學(xué)與生物工程，2007（8）：72-75.
[9] Weuster-Botz D. Experimental design for fermentation media development: statistical design or global randomsearch [J].J Biosci Bioeng,2000,90:473-483.
[10] 閻金勇，楊江科閆云君.單因子響應面法優(yōu)化白地霉Y126 產(chǎn)脂肪酶條件[M].中國生物工程雜志：2007，27（8）：69-75
[11] Sharma R, ChistiY, Banerjee U C. Production, purification, characterization, and applications of lipases.Biotechnology Advances, 2001, 19: 627-662
【響應面法優(yōu)化耐有機溶劑脂肪酶營(yíng)養條件】相關(guān)文章：
有機溶劑回收的常用方法01-01
應從四方面細化附條件不起訴制度12-09
有機溶劑壓裂提高煤層滲透率的方法03-18
論資本結構優(yōu)化目標與資本結構優(yōu)化03-01
優(yōu)化課堂結構03-19