抗生素微生物檢定及比濁法在效價(jià)測定中關(guān)鍵控制點(diǎn)

　　自1929年英國細菌學(xué)家弗來(lái)明發(fā)現了第1個(gè)抗生素一青霉素至今已有半個(gè)多世紀，隨著(zhù)抗生素種類(lèi)不斷增加，在治療感染性疾病和保障健康方面作出了令人矚目的貢獻。在當今世界醫學(xué)臨床上，抗生素類(lèi)藥物已是一類(lèi)不可缺少的重要化學(xué)藥物，在很多國家的醫藥T業(yè)中產(chǎn)值均居于首位�？股�素在農牧業(yè)上也被廣泛應用，隨著(zhù)抗生素應用范圍的擴大，對抗生素藥品的分析工作更加繁重，現代化學(xué)分析技術(shù)不斷發(fā)展，特別是各種儀器分析和自動(dòng)分析技術(shù)的日新月異，有可能對各種抗生素進(jìn)行有效的快速測定，但傳統的生物檢測法及經(jīng)典的化學(xué)分析方法還是目前各國藥典中采用最多、最主要的檢測方法。為保證抗生素藥品的安全有效性，對抗生素藥品的檢測及質(zhì)量控制顯得尤為重要。
　　抗生素微生物檢定法是國際上通用的經(jīng)典測定法，由于微生物檢定法的特點(diǎn)是直觀(guān)和特異地反應抗生素藥品抗菌活性的差異，化學(xué)測定結果難于準確表征組分組成、含量和活性的關(guān)系，許多抗生素品種由于各種原因， 目前沒(méi)有適當的化學(xué)分析方法表征其活性，同時(shí)，微生物檢定法所需的儀器設備簡(jiǎn)單，成本低廉，故抗生素微生物檢定法目前在各國藥典中仍占有重要地位。
　　
　　1 分類(lèi)
　　
　　單組分抗生素由于結構明確，含量和生物活性相一致，采用化學(xué)分析方法測定含量是其發(fā)展趨勢，但對于慶大霉素、乙酰螺旋霉素和吉他霉素等多組分抗生素來(lái)說(shuō)，各國藥典均采用微生物效價(jià)測定法。
　　由于抗生素對微生物具有殺菌和抑菌作用，這是其他物理學(xué)或化學(xué)方法不能達到的，因此，用抗生素對細菌的抑制程度來(lái)檢定和表示效價(jià)是有實(shí)際意義的�？股�素微生物檢定法可分為稀釋法、比濁法和管碟法。
　　
　　2 微生物比濁法測定原理及優(yōu)點(diǎn)
　　
　　將不同質(zhì)量濃度的標準品、供試品和接有試驗菌的液體培養基加入比色池中，經(jīng)培養一定時(shí)間，約3～4 h，通過(guò)抗生素對細菌的抑制作用來(lái)觀(guān)察試驗菌生長(cháng)混濁度，其混濁程度與細菌數的增加存在直接關(guān)系，當一定光束照射在混濁的液體培養基時(shí)，測定其透光率。
　　采用抗生素比濁法測定抗生素，保證了濁度測定中的培養溫度、培養時(shí)間和測量結果的均一性，實(shí)現了在線(xiàn)檢測，并通過(guò)試驗材料的標準化和統一化，控制培養基和緩沖液的質(zhì)量，可保證相對穩定的水平，降低抗生素微生物檢定的測定誤差，耗時(shí)短，出結果快速，降低可信限率，借助儀器檢測可同時(shí)測量3批樣品，減少人為因素。
　　
　　3 抗生素微生物檢定比濁法在效價(jià)測定中關(guān)鍵控制點(diǎn)
　　
　　3．1培養溫度的控制比濁法對溫度的要求較管碟法更加精確，管碟法的培養溫度要求(37±0．5)℃ ，而比濁法為(37±0．1)℃，對溫度的要求更加嚴格，在比濁法培養過(guò)程中，溫度的均一性控制非常重要，保證各點(diǎn)溫度的均勻是保證細菌正常生長(cháng)的關(guān)鍵因素，也是試驗成功的重要因素。
　　
　　3．2儀器結構與比色池的排列采用的儀器型號為WBS一100微生物比濁法測定儀(北京先驅威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，其排降為拉丁方排列，可抵消培養過(guò)程中區域性的誤差，使分組更加明確，排除培養基加入時(shí)間先后的誤差。儀器中的感溫器必須正確放置，使溫度得到更好的控制。試驗中采用振搖培養，不致使細菌沉降于比色池底部，增加氧氣循環(huán)，有利于細菌生長(cháng)。
　　
　　3. 3菌液的影響因素配制：取金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)的第三代營(yíng)養瓊脂斜面培養物，接種于營(yíng)養瓊脂斜面上，35～37 cI=培養2O～22 h后，用0．9％ 無(wú)菌氯化鈉注射液洗下菌苔備用。菌液應當天配制，當天使用。如采用冰箱放置第2天使用的菌液，此時(shí)菌液中的細菌開(kāi)始老化，并部分死亡，所測出的數據不穩定，造成較大的誤差。
　　
　　3．4培養基成分及pH的影響細菌的生長(cháng)速度，在沒(méi)有外加抑制物存在的情況下與培養基的成分、pH、培養溫度、通氣條件及細菌內在的繁殖能力有關(guān)。培養基的營(yíng)養成分應能滿(mǎn)足細菌快速生長(cháng)的需要，培養基的pH也是影響細菌生長(cháng)的關(guān)鍵。一般情況下，pH偏低會(huì )導致金黃色葡萄球菌生長(cháng)緩慢，使培養物濁度減少，誤差增大，pH過(guò)高也會(huì )導致結果偏離，所以，適宜培養基的pH滅菌后應在7～7．2。
　　
　　3．5比色池清潔度的影響測定用的比色池應采用硫酸一硝酸(95：5)浸泡，并用蒸餾水沖洗干凈�？股�素比濁法測量質(zhì)量濃度一般為0．1～1 U／mL，而原始溶液質(zhì)量濃度為1 000 U／mL。在稀釋過(guò)程中，所有試驗物品一定要清洗干凈，消毒滅菌，試驗中一旦污染會(huì )導致被污染管濁度異�；蛟斐赏�質(zhì)量濃度抗生素管結果差異明顯，可信限升高(可信限率(FL)％)，可采用清水沖洗高質(zhì)量濃度器具，采用專(zhuān)用洗刷池為宜，并與培養后的比色池或試管分開(kāi)清洗，清洗時(shí)不得用毛刷，防止劃痕。
　　
　　3．6氣泡的影響因素待加人各種所需物質(zhì)后，將比色池物質(zhì)充分混勻，采用WBS一100微生物比濁法測定儀，可自動(dòng)間歇振搖，振搖時(shí)不得產(chǎn)生氣泡，有氣泡則干擾測定結果，此點(diǎn)尤為重要。
　　
　　3．7微生物的污染(菌種不純)在配制菌懸液時(shí)所用器皿必須嚴格高壓滅菌，切忌使用未經(jīng)滅菌的試管及物品進(jìn)行試驗，防止造成原始菌液的污染。另外，菌液的不純也屬于微生物污染，表明正常試驗菌種被其他雜菌所污染，從而導致生物反應紊亂，導致細菌對抗生素的反應靈敏度降低，曲線(xiàn)不規則等現象。使精密度差，因此，在操作中要保持試驗環(huán)境清潔，嚴防污染微生物，一旦被污染，可重新開(kāi)啟一支凍干菌種，從新傳代，致使試驗菌達到要求。
　　
　　3．8時(shí)間的一致性在加入標準品和供試品溶液及含試驗菌的培養基后，混合均勻，為防止培養基中的試驗菌提前生長(cháng)，必要時(shí)將培養基放置2～4℃冷卻，適時(shí)取出加入菌液，此法可避免試驗時(shí)加注時(shí)間過(guò)長(cháng)和加入先后不同而造成誤差，每個(gè)比色池的培養時(shí)間應一致。
　　
　　3．9抗生素微生物比濁法展望隨著(zhù)抗生素微生物比濁法的出現，2012年獸藥典將收載約10個(gè)抗生素品種采用比濁法測定效價(jià)，這將大大減少耗時(shí)和提高檢測效率。隨著(zhù)檢測技術(shù)的不斷提高，抗生素微生物檢定比濁法在菌液質(zhì)量濃度和加菌量、抗生素質(zhì)量濃度的稀釋范圍、培養基、緩沖液標準控制、培養時(shí)間、溫度、樣品和標準品質(zhì)量濃度的制備、上機質(zhì)量濃度范圍、全程試驗的環(huán)境條件及所用物品的滅菌要求，污物的處理等應制定出嚴格的規范和要求，是抗生素微生物檢定比濁法的發(fā)展方向。

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