管碟法測定抗生素效價(jià)中的影響因素分析及對策

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 管碟法；抗生素；效價(jià)；抑菌圈 
摘　　要: 目的 提高管碟法測定抗生素效價(jià)的準確性。 按操作步驟逐步，并提出合理的解決方案。 結果 減少外界因素與人為因素給試驗帶來(lái)的誤差。 結論 可以提高測定結果的準確性。 
  Abstract:  OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method.  METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors.  RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors.  CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words:  cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring   管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法[1]，利用管碟法測定抗生素效價(jià)，具有準確、直觀(guān)、重復性好等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛采用。但是整個(gè)試驗過(guò)程中結果的因素很多，任何一個(gè)環(huán)節操作不當或者忽略就會(huì )造成很大誤差，導致整組試驗失敗。根據實(shí)際操作中的積累經(jīng)驗，對管碟法中影響試驗結果的因素進(jìn)行如下分析及提出解決的方法。   1. 實(shí)驗器材的準備 1.1 實(shí)驗器材的選擇 試驗應該選擇底面平整的玻璃雙碟，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度�？蓪㈦p碟放置在水平臺上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍墨水，根據藍色是否深淺一致來(lái)判斷雙碟底面平整程度。小鋼管則應該選擇加工精細的同一批產(chǎn)品，這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致，使得小鋼管在培養基中下陷相同的深度，抗生素溶液擴散均勻有可比性。如果小鋼管兩端不夠平，就應予剔除，否則會(huì )使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴散現象。 1.2 實(shí)驗器材的清洗 抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會(huì )連續使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現象。因此，在清洗時(shí)要尤為注意多用流水沖洗。160℃干熱滅菌2h后備用。   2. 配制試驗所需的樣品、標準品、緩沖液與培養基 2.1 樣品與標準品溶液的配制 標準品與樣品從冰箱取出后，使與室溫平衡。供試品應放于干燥器內至少30min方可稱(chēng)取。稱(chēng)量最好為一次取樣稱(chēng)量，動(dòng)作迅速，不得反復稱(chēng)取，取樣后立即將稱(chēng)量瓶瓶蓋蓋好，以免吸水。標準品的稱(chēng)量最好用1/100,000克的分析天平，樣品稱(chēng)量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥劑應保持經(jīng)常注意更換。稱(chēng)量結束后，加入超聲波處理后的磷酸緩沖液，定容至刻度，過(guò)濾并稀釋。稀釋時(shí)，都應采用容量瓶，每一步稀釋取樣量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把刻度吸管外壁多余液體擦去，再從起始刻度開(kāi)始放溶液。把稀釋后的抗生素溶液分裝至干燥滅菌試管待用。在稱(chēng)量抗生素樣品過(guò)程中，操作者的工作服上有可能會(huì )沾染抗生素粉末，在配培養基、加底層培養基、加菌層培養基或滴加抗生素溶液時(shí)，會(huì )隨衣袖的抖動(dòng)落入培養基，造成破圈或者無(wú)抑菌圈。所以配制抗生素溶液應單獨使用一套工作服。 2.2 培養基與緩沖液的配制 配制培養基與緩沖液時(shí)要按照的配比用量，配制后調節其pH值。因為在pH值、鹽濃度的影響下，即使瓊脂培養基上的兩個(gè)相鄰的小管距離足夠，還是可能會(huì )出現卵圓形抑菌圈。例如四環(huán)素易受pH值影響，鏈霉素易受鹽濃度影響[2]。培養基可以購買(mǎi)廠(chǎng)家生產(chǎn)的產(chǎn)品，因為大批量產(chǎn)品中的成分配比較穩定，可比性較強。116℃濕熱滅菌20min后備用。   3. 加注培養基 3.1 加注底層培養基
無(wú)菌室工作臺面可能因為使用時(shí)間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會(huì )培養基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會(huì )給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區域的平整。在雙碟底部預先標記樣品的高低濃度區域，在加注培養基底層的時(shí)候，有順序地按照一致方向排列。接下來(lái)加注培養基菌層的時(shí)候，仍然按照原來(lái)的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養基菌層是在水平的培養基底層上鋪開(kāi)，達到消除誤差的目的。 試驗中加注的培養基如果溫度太低，就容易在內部結塊，或者加注到雙碟之后不能及時(shí)鋪開(kāi)，使得培養基表面為非水平面，會(huì )給試驗帶來(lái)誤差。加注60～80℃的培養基底層之后，不應立即給雙碟加蓋。因為溫度過(guò)高的培養基會(huì )形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養基底層上，會(huì )給培養基菌層的加注帶來(lái)影響。 3.2 加注培養基菌層 制備瓊脂培養基菌層時(shí)，培養基溫度過(guò)高或者受熱時(shí)間太長(cháng)都會(huì )導致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時(shí)候，現象尤為明顯，甚至會(huì )出現無(wú)菌生長(cháng)。因此，培養基應放在50℃水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后，應盡快加注到底層培養基上。在試驗的時(shí)候，如果從大瓶?jì)扔每潭任�管吸取帶菌培養基，吸管中培養基量少極易冷卻，加在底層培養基上就不易均勻鋪開(kāi)，導致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養基分裝在具塞試管內，每管5mL，濕熱滅菌后放在50℃水浴鍋內保溫。試驗中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續保溫5min使培養基溫度回升，然后直接倒在底層培養基上，轉動(dòng)雙碟使培養基均勻鋪開(kāi)。   4. 放置小鋼管 放置小鋼管時(shí)，注意管與管之間不能太靠近，否則會(huì )引起相鄰的兩個(gè)抑菌圈之間的抗生素擴散區中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養基菌層為非平面，會(huì )影響抑菌圈的形狀�？稍谠囼炃霸陔p碟的底上用尺測量，作好標記，試驗中可以按照雙碟底面標記放置小鋼管，避免放置位置不恰當產(chǎn)生的。小鋼管放置時(shí)，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的。放置之后，不能隨意移動(dòng)，要靜置5min，使之在瓊脂內稍下沉降穩定后，再開(kāi)始滴加抗生素溶液。   5. 滴加抗生素溶液 滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二劑量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三劑量法）的順序滴加[3]。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時(shí)候，由于毛細管內抗生素溶液往往會(huì )有氣泡或者毛細管開(kāi)口端有液體殘留，繼續滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進(jìn)行滴加，毛細管口應避免太細，滴加的時(shí)候離開(kāi)小鋼管口距離不要太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現抗生素溶液滴入小鋼管后，沒(méi)有與瓊脂培養基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養基之間，這樣是不會(huì )產(chǎn)生抑菌圈的。此時(shí)可以小心的用滴管吸出小鋼管內的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加�？股�素溶液滴加后，液面應該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過(guò)滿(mǎn)，可以用無(wú)菌濾紙片小心吸去多余部分。   6. 雙碟中菌株的培養 滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動(dòng)，要輕拿輕放。在搬運到培養箱的過(guò)程中，可以預先在培養箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養箱，緩慢推入箱內。雙碟在37℃下培養約16h。時(shí)間太短會(huì )造成抑菌圈模糊，太長(cháng)則會(huì )使菌株對抗生素的敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續生長(cháng)，使得抑菌圈變小。在培養過(guò)程中，如果溫度不均勻（過(guò)于接近熱源），會(huì )造成同一雙碟上細菌生長(cháng)速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養箱時(shí)，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過(guò)3個(gè)。培養中，箱門(mén)不得隨意開(kāi)啟，以免影響溫度。應經(jīng)常注意溫度，防止意外過(guò)冷過(guò)熱。
  7. 抑菌圈測量 7.1 試驗結果中抑菌圈直徑不應該過(guò)大或者過(guò)小，在試驗之前，可以先做一個(gè)關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養基菌層預試驗，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度為試驗用濃度（菌液濃度約為106個(gè)/mL）。批量試驗中后期，菌液保存的時(shí)間過(guò)久，菌株就會(huì )逐漸衰亡，生長(cháng)周期不一致，其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈。如若菌株不純，也會(huì )造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時(shí)間后，可以重新配制純化或者減小原來(lái)菌液在使用中的稀釋倍數。 7.2 用游標卡尺測量抑菌圈直徑，可以在雙碟底部墊一張黑紙，在燈光下測量。不宜取去小鋼管再測量，因為小鋼管中殘余的抗生素溶液會(huì )流出擴散，使抑菌圈變得模糊。不能把雙碟翻轉過(guò)來(lái)測量抑菌圈直徑，因為底面玻璃折射會(huì )影響抑菌圈測量的準確度。記錄測量結果后進(jìn)行效價(jià)。   8.討論     試驗中，往往會(huì )出現異常情況，使得試驗結果與預期出現很大差異。因此抗生素試驗的每一步都需要仔細謹慎，嚴格按照操作規范，才可以得到準確的檢測結果。準確測定抗生素效價(jià)，對評價(jià)抗生素的效果，指導臨床都有著(zhù)重要意義。

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