淺析非病毒載體基因轉移技術(shù)的現狀和展望

摘要：目前基因治療已經(jīng)成為科學(xué)家治療多種難治性疾病的一種新手段，基因導入技術(shù)是基因治療的核心也是最基本的技術(shù)。目前研究較多的基因導入技術(shù)共分為兩大類(lèi)：一，病毒載體基因導入法；二，非病毒載體基因導入法。前者轉染效率高,但存在安全性和免疫原性等問(wèn)題。因此,近年來(lái)人們對非病毒類(lèi)載體系統給予了更多的關(guān)注。

關(guān)鍵詞： 非病毒載體 基因轉移技術(shù) 現狀和展望

非病毒載體基因轉移方法又分為物理方法和化學(xué)方法。物理方法如：注射法、基因槍法、電穿孔法、超聲波法等都是借助物理力量穿透細胞膜達到基因轉移的目的；化學(xué)方法則是借助天然的或者人工合成的化合物輔助完成基因轉移。盡管近年來(lái)在非病毒基因轉移領(lǐng)域中取得了顯著(zhù)成效，但總體而言，非病毒載體相對于病毒載體來(lái)說(shuō)轉移基因的效率要低，在體內的基因轉移尤其如此�，F在把目前較常用的非病毒載體基因轉移方法的優(yōu)勢和局限綜述如下。
1 物理方法
就是基于物理力量造成細胞膜的瞬間缺損，從而使質(zhì)粒DNA進(jìn)入細胞內的方法。如基因槍法、電穿孔法、超聲波法等，還有近年來(lái)發(fā)現的激光相關(guān)輔助方法。
1.1 注射法
直接將質(zhì)粒DNA注射入組織細胞中達到基因轉移的目的。有學(xué)者成功地將裸露的質(zhì)粒DNA注射入肌肉、肝臟[1]、皮膚[2]等組織，但基因表達水平較低。注射法中，細胞表面的某些受體起了一定的作用，它們能夠特異或者非特異性地結合DNA并且介導DNA的內吞，但這些受體的詳細作用機制不甚清楚。由于注射法有其獨特優(yōu)點(diǎn)如：方法簡(jiǎn)單，不需特殊試劑且毒性低而受到歡迎。此外，借助顯微操作系統進(jìn)行的顯微注射法是目前國際上公認的制備轉基因和基因剔除動(dòng)物模型的首選。
1.2 基因槍法
基因槍法是一種全新的基因導入技術(shù)，它以壓縮氣體（氦或氮）轉換成的氣體沖擊波為動(dòng)力，把附著(zhù)于高速微彈上的DNA直接射入細胞、組織和細胞器，基因槍導入的基因被證明可在廣泛類(lèi)型的細胞中得到瞬時(shí)的、高效率的表達�；�因槍法是皮膚、黏膜以及手術(shù)局部暴露組織較理想的基因轉移方法，因而基因槍被認為是將來(lái)DNA疫苗的良好免疫工具。但是基因槍法用于基因治療還需要進(jìn)一步改進(jìn)，如通過(guò)對微彈顆粒表面結構的改良使其可以結合更多的DNA或者使結合更緊密；通過(guò)對氣體沖擊波壓力的調節來(lái)調控微彈的運動(dòng)軌跡等。
1.3 電穿孔法
通過(guò)短暫的高強度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細胞膜的通透性，從而將周?chē)�介質(zhì)中的外源核酸分子導入細胞內。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內的基因轉移方法。理論上任何可以插入兩個(gè)電極的組織器官都可以用電穿孔法導入外源基因，然而目前體內用電穿孔法導入基因主要用于皮膚和肌肉組織。100KD的DNA被報道可以利用電穿孔的方法成功導入肌肉組織中[3]。電穿孔導入的外源基因也有被報道長(cháng)期穩定表達超過(guò)1年時(shí)間[4]。本課題組前期工作中利用電穿孔法將質(zhì)粒pGFP?N2導入白血病細胞株K562中后，經(jīng)過(guò)篩選培養，最終表達綠色熒光的細胞高達90％以上,穩定表達時(shí)間在半年以上[5]。該方法轉移基因時(shí)，DNA的濃度以及DNA在組織中的分布對電穿孔的效率至關(guān)重要。用電穿孔法進(jìn)行體內基因導入時(shí)存在如下局限：①兩個(gè)電極的距離不能超過(guò)1cm，這樣就很難實(shí)現大面積的細胞同時(shí)基因轉移；②如果是內臟的基因導入，必須借助外科手術(shù)放置電極，損傷較大；③該法所用的電壓較高，容易導致局部組織細胞被電灼傷。此外，較高電壓作用于細胞后可能會(huì )影響細胞自身基因組DNA的穩定性。以上局限性有望通過(guò)對電極的優(yōu)化及電場(chǎng)強度的調節而減少到最低。值得一提的是現在出現了類(lèi)似于傳統電穿孔法的細胞核轉染法，借助細胞核轉染儀，采用獨特的電場(chǎng)參數與細胞類(lèi)型特異性的轉染溶液相結合的方法，將細胞轉染效率大大的提高，而細胞的死亡率則大大的降低。轉染條件對于不同的細胞不需要摸索和優(yōu)化，而且絕大多數細胞被轉染后4h就可以見(jiàn)到轉染基因的表達。
1.4 超聲波法
超聲波在醫學(xué)領(lǐng)域分為診斷性超聲和治療性超聲。治療性超聲常用于組織深部加熱、緩解局部疼痛和促進(jìn)炎癥吸收等。超聲在一定的波長(cháng)和強度下能增加血管和細胞膜的通透性，尤其有利于全身用藥和轉基因時(shí)藥物和DNA在局部組織細胞的定位。超聲波法比單純DNA注射法的基因轉移效率要高10～20倍。該法用于基因轉移的效率受諸多因素影響：如超聲波的頻率、強度和作用時(shí)間以及所用質(zhì)粒DNA的量等。此外，由于造影劑在超聲波作用下變?yōu)檠杆贁U張和縮小的含氣泡沫，從而在局部產(chǎn)生波動(dòng)，使臨近細胞膜通透性瞬間增加，所以造影劑的使用可以增加超聲波的基因轉移效率。與電穿孔不同，超聲波作用后細胞膜出現微孔，基因通過(guò)自由擴散的方式通過(guò)微孔進(jìn)入細胞，因而質(zhì)粒DNA的大小及濃度對基因轉移效率影響較大。超聲波用于體內組織器官基因導入的優(yōu)勢在于其為一種無(wú)創(chuàng )的基因轉移方法。然而到目前為止，超聲波用于基因轉移的主要局限在于其效率較低。
2 化學(xué)方法
目前非病毒載體基因轉移方法中研究最熱門(mén)的還是陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物介導的基因轉移，攜帶目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體或聚合物通過(guò)細胞吞噬或吞飲作用進(jìn)入靶細胞中，一部分目的基因將在胞漿中被釋放出來(lái)并轉移入細胞核發(fā)揮作用。
2.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導的基因轉移
自從Felgner等科學(xué)家[6]于1987年首次發(fā)現脂質(zhì)體具有轉移基因的作用后，大量的陽(yáng)離子脂質(zhì)體被改良后用于基因的轉移。這些脂質(zhì)體主要區別在于它們所帶電荷及細微結構的不同。盡管有部分脂質(zhì)單獨就可以形成囊泡發(fā)揮較好的基因轉移作用，但很多陽(yáng)離子脂質(zhì)需要磷脂或者膽固醇輔助作用下才能形成脂質(zhì)體囊泡。當把目的DNA與這種脂質(zhì)體混合后，DNA就會(huì )濃縮并與之形成較穩定的脂質(zhì)體DNA復合物(lipoplex)。由于脂質(zhì)體具有類(lèi)似生物膜的性質(zhì)，因此當脂質(zhì)體DNA復合物與細胞膜接觸后，通過(guò)胞吞作用而進(jìn)入胞內。如今不斷改良的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑在穩定轉染、瞬時(shí)轉染以及難以轉染的細胞系應用中都表現出超乎尋常的效果。此外，脂質(zhì)體沒(méi)有免疫原性,細胞毒性小,而且也易于制備,因此陽(yáng)離子脂質(zhì)體已成為現今用于基因轉移的最常用方法之一。
為了達到特異性基因轉移的目的，科學(xué)家們相繼開(kāi)發(fā)了免疫脂質(zhì)體和配體脂質(zhì)體[7]。免疫脂質(zhì)體或配體脂質(zhì)體的靶向技術(shù)是通過(guò)將脂質(zhì)體與單克隆抗體或配體共價(jià)結合成免疫脂質(zhì)體或配體脂質(zhì)

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