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關(guān)于泡盛曲霉生成酸性蛋白酶調節問(wèn)題的研究
對于微生物細胞所分泌的酶的形成物的調節，可按負反饋原理進(jìn)行。曾發(fā)現在培養基中則含有這些酶類(lèi)，如黃曲霉(Aspergillusoryzae)的a一淀粉酶。隨后又確定，用同樣的方法，又發(fā)現在酵母機體中對所分泌的日一果糖普酶(轉化酶)的形成物具有調節作用。根據這種調節機理可以闡明許多特性，其結論是:這種調節原理應進(jìn)一步加以擴展。本文提供這樣的結果，即可斷定，當培養基中含有蛋白酶時(shí)，對Aspergillusawan:。ri所分泌的蛋白酶的形成物，存在著(zhù)調節作用。關(guān)于這點(diǎn)早已有所報導。
試驗是用AspergilluSawamori78一2的培養物進(jìn)行的。這一菌株是由C.A.卡諾凡洛夫(C.A.KoH。:a二oB)和T.B.沙霍夫(T.B.山。xoB)分離而得的。所產(chǎn)生的蛋白酶(np0Tea3a，阮酶)，實(shí)際上是一種酸性蛋白酶，其能大量地產(chǎn)生這種酶。
霉菌培養在1升中含有如下成分的培養基質(zhì)中，其配方為:磷酸二氫鉀一5克，硫酸鎂一20毫克，硫酸鋅一20毫克，硫酸鐵一20毫克，黑麥粉提出液(在200毫升水中加入20毫克麥粉，在溫度+2“c的條件下經(jīng)17小時(shí)，然后經(jīng)離心分離而制得)，PHS。6，應當指出:在培養基的條件中，特別重要的是蛋白質(zhì)的含量，為此，在研究工作中特別要選擇這樣的方法，即使其保證在無(wú)抑制的條件下大量地形成蛋白酶，而蛋白酶則由蛋白分解物而合成。菌種培養在麥芽汁一瓊脂培養基上，系用胞子懸浮液進(jìn)行接種。培養物放置在搖床上(溫度26OC)，在通氣的條件下培養一晝夜。
對培養液和菌絲體中的蛋白酶活性進(jìn)行了測定。后者與玻璃粉一道研磨2分鐘，并在室溫下浸泡一小時(shí)。測定活性系按研究誘發(fā)變異方面的M.阿恩沙(M.AHCOH)的方法、T.B.沙霍夫和C.A.卡諾凡洛夫的方法而進(jìn)行的。其利用溶解在PHI.9的鹽酸甘油緩沖液中的公牛血紅蛋白(BH:二達FeMoT二。6oH)而作為培養基質(zhì)的。反應過(guò)的混合物PH2.3。其在適當的基質(zhì)濃度和控制地加入兩倍體積的5%三氯乙酸的條件下，按初速狀態(tài)進(jìn)行反應�；钚允前�1克菌絲體中所形成的酪氨酸(Topo3oH)的數量(按毫克計)而表示的。
在上述條件下，為了弄清楚當培養基中存在過(guò)量的酶制劑時(shí)對細胞分泌酶形成物的壓抑作用，可在接種前將從同類(lèi)試物中分離出來(lái)的酶制劑加入培養基中，這樣使其建立具有一定濃度蛋白酶的條件。
作者曾由培養在含有黑麥粉(2%)培養基中的Aspergillusawamori78一2培養液中制取了酸性蛋白酶制劑。試驗的程序也正如以前所敘述過(guò)的那樣，提出了三個(gè)方案:
l)加入酶制劑的原始培養基;
2)在這種培養基上所得的霉菌培養物;
3)未加入酶制劑的霉菌培養物。
為了探索調節因子的作用界限，則將酶制劑按不同濃度加入培養基中。酶的水溶液則通過(guò)細菌過(guò)濾器進(jìn)行消毒。在試驗過(guò)程中，向培養基中所加的酶活性和培養基的PH是不變的。在不同的試驗方案中培養物的生長(cháng)情況，均未發(fā)現異�，F象。
在表中列出了典型試驗的結果。由表可見(jiàn)，培養基中的酶對于酶分泌物的形成顯示著(zhù)一定的壓抑作用。培養基中蛋白酶濃度愈高，那末，細胞形成物在更大程度上處于受壓抑的地位。壓抑僅屬于酶的分泌部份。在某種條件下，而細胞中蛋白酶活性的水平甚至還會(huì )提高一些。但是，這一提高遠不能補償酶分泌部份因活性的受壓抑所遭的損害。!二述現象，即復現了在研究其它試驗物時(shí)早就揭示的規律性。
[1]
在以前的研究中已獲得大量數據，研究所得的效應可視為調節原理。并確定，培養基中所具有的活性酶就是調節因子。H.C.依加洛夫(H.C.EropoB)及其同事們對具有水解能力的色氏菌(Serratiamarcesce。)所分泌的蛋白酶的詳盡的調節機理進(jìn)行了深入探討。
從所進(jìn)行的一系列對照試驗中，其使我們深信，在上述的因子中，我們找到了在培養基中含有調節因子對培養物分泌酶的調節作用的新例證。而沒(méi)有可仿造的這種規律性的任何的其它現象，首先必須弄清楚，在我們的條件下，尚沒(méi)有產(chǎn)生蛋白分解產(chǎn)物對蛋白酶形成物的壓抑。而壓抑是在向培養基中加入酶制劑的作用條件下形成的。在試驗中曾向培養基中加入了由Aspergillusawamori78一2所得蛋白酶制劑的最大劑量(2毫克)。在同樣的條件下，在任何培養物中均可培育出這種反應混合物。當加熱使酶鈍化后，再將抱子接入這種培養基中。試驗結果指出:無(wú)論在培養基中或菌絲體中的酶活性均不可能優(yōu)于將霉菌培養在無(wú)酶制劑的條件下所獲得的酶活性。
因此，在我們所進(jìn)行的試驗中，在具有蛋白質(zhì)的培養基中，對于其降解產(chǎn)物蛋白酶的形成方面，并沒(méi)有出現壓抑作用。顯然，這應該這樣解釋?zhuān)淳哂袎阂中再|(zhì)的蛋白分解產(chǎn)物的濃度，在我們的試驗條件下，并沒(méi)有達到真正的界限數值。根據所得數據可得出這樣的結論:由于加熱而遭鈍化的酶，對于霉菌細胞的酸性蛋白酶的形成并不起壓抑作用。關(guān)于這一點(diǎn)，在將鈍化過(guò)的酶加入原始培養基的試驗中得到了證實(shí)。
此外，在試驗過(guò)程中，我們還就霉菌生命活動(dòng)的產(chǎn)物或培養基中的蛋白質(zhì)被自身酶分解所得產(chǎn)物對被加入培養基中的蛋白酶鈍化與否的可能性進(jìn)行了驗證。假如發(fā)生這樣的鈍化作用，那末就可摹擬在霉菌細胞繼續分泌的條件下對酶形成物的壓抑作用。試驗結果指出:上述的因子并不影響酶活性。在我們的試驗條件下，以及在原始培養基中培育酶的條件下，酸性蛋白酶同樣是不變化的。
最后，可以設想，由于摹擬形成物的壓抑作用而被霉菌細胞鈍化吸附的結果，所加入的酶活性會(huì )有所降低。大家知道，活細胞具有吸離培養基中酶的能力，而同樣在吸離作用條件下，也會(huì )失去酶活性。我們曾確定，Aspergillusawamori78一2的細胞并不能吸住從這種霉菌培養物中所獲得的大量的酸性蛋白酶(按活性計)從所列舉的上述因子指出:在我們的試驗條件下，無(wú)論在本身培養基因子的影響下，也無(wú)論在細胞作用于所具有的酶的影響下，培養基中的酸性蛋白酶的活性都是不會(huì )降低的。在蛋白分解產(chǎn)物的影響下或在霉菌生命活動(dòng)過(guò)程中所積累的其它產(chǎn)物的影響下，同樣也不會(huì )發(fā)生對酶細胞形成物的壓抑作用。這樣，若存在于墻養基中的Aspergillusawamori78一2所具有的本身的活性的酸性蛋白酶的濃度超過(guò)了極限，則霉菌細胞會(huì )對這種酶的形成起著(zhù)壓抑作用。根據所得的結果與原先發(fā)表的資料進(jìn)行對照的同時(shí)，可以得出結論:上述的因子是在培養基中所含有的酸性蛋白酶按照反饋原理，對分泌酶的形成物調節的新條件。
[2]
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