平貝母內生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究

平貝母內生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究 ［摘要］ 目的 從平貝母植株中分離內生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規微生物學(xué)方法分離出其中的內生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對這些真菌的提取物進(jìn)行生物堿定性檢測；再對陽(yáng)性樣品進(jìn)行TLC分析，并與藥材提取物進(jìn)行比較。結果 從平貝母幼苗中共分離出9種內生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應中都呈陽(yáng)性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現兩個(gè)與藥材樣品有相同Rf值的斑點(diǎn)。結論 該內生真菌菌株應具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

　�。坳P(guān)鍵詞］ 平貝母；內生真菌；生物堿

平貝母（Fritillaria ussuriensis）為常用中藥材，其中的貝母堿類(lèi)化合物有清熱潤肺、止咳化痰等功效。由于對其需求量大，而且植株生長(cháng)緩慢，野生資源人為破壞嚴重，自1987年起便被《中國珍稀瀕危保護植物名錄》列為漸危種［1］。植物內生真菌是指生活在植物體內或生活史的一定階段處于植物體內的真菌，它們在植物體內的存在具有一定的普遍性，其中一部分可能產(chǎn)生一些與其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治療人類(lèi)疾病的藥物［2，3］。因此，如果能從貝母中分離出可以產(chǎn)生貝母堿類(lèi)生物堿的內生真菌，就有可能采用工業(yè)發(fā)酵的方法生產(chǎn)其藥用成分，這樣不僅可以改善目前該藥材緊缺的狀況，還有利于保護這種珍貴的藥用植物資源。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗材料

　　平貝母引種自吉林市左家中國特產(chǎn)所，栽種于西北大學(xué)校園生物實(shí)驗地，春季取整株幼苗作為分離內生真菌的實(shí)驗材料。平貝母藥材（干燥鱗莖）購自中藥店。

　　1.2 實(shí)驗方法

　　1.2.1 內生真菌的分離

　　用自來(lái)水洗凈幼苗上的泥土，在75%酒精中迅速漂洗一下，無(wú)菌水沖洗后移入5%的次氯酸鈉溶液中浸泡8 min，最后用無(wú)菌水洗3~5遍。將幼苗切成小段，接種到馬丁培養基平板上，置25 ℃條件下培養，切斷邊緣長(cháng)出菌絲后，按常規方法進(jìn)行分離、純化后轉接到PDA斜面上備用。

　　1.2.2 培養

　　將在PDA平板上培養的旺盛生長(cháng)的各菌株菌絲體制成懸液，分別等量接種于裝有50 ml馬鈴薯葡萄糖液體培養基的三角瓶中，每種接5瓶。置往復式搖床上25 ℃條件下培養，震蕩速度約100次/min。培養5~7天后，將各待測培養物中的菌絲體和培養液過(guò)濾分開(kāi)，菌絲體在60 ℃下烘干備用，濾出的培養液直接用于生物堿的定性檢測。

　　1.2.3 樣品檢測

　　將上述各種菌絲體研碎，分別用80％酒精熱提2次，蒸去酒精，濃縮液滴加5%鹽酸使成酸性，過(guò)濾［4］，即為用于生物堿定性檢測的提取液。

取各樣品的菌絲體提取液和培養液少量，分別滴加1~2滴以下3種試劑：（1）碘化鉍鉀試劑（Dragendorff’s reagent），若產(chǎn)生黃至桔紅色沉淀則為陽(yáng)性反應；（2）碘-碘化鉀試劑，若產(chǎn)生棕色或褐色沉淀為正反應；（3）碘化汞鉀試劑（Mayer’s reagent），生成類(lèi)白色沉淀者為正反應［5］。

選取上述檢測呈陽(yáng)性的真菌進(jìn)一步進(jìn)行薄層層析（TLC）分析。將干燥的平貝母藥材粉碎，過(guò)60目篩作為對照品，與待測菌絲體都于60 ℃烘箱中烘至恒重，按文獻6方法制備樣品［6］。將對照品和樣品提取液都點(diǎn)樣于硅膠G薄板，采用環(huán)己烷-醋酸乙酯-二乙胺（6∶4∶1）作為展開(kāi)劑，改良碘化鉍鉀試劑為顯色劑，進(jìn)行TLC檢測。

　　2 實(shí)驗結果與討論

從平貝母幼苗中共分離出9種內生真菌，分別以Fu1~Fu9表示之。培養液的3種定性反應除少數為不確定結果外，均為陰性反應，說(shuō)明其中不含生物堿或生物堿濃度很低。菌絲體提取液的定性反應結果如表1所示。表1 各種內生真菌菌絲體提取液的定性反應結果（略）

從表1中可以看出：Fu7菌株的菌絲體提取液在上述3種定性反應中都呈明確陽(yáng)性，說(shuō)明它具有產(chǎn)生生物堿的能力，因此將其進(jìn)行進(jìn)一步的TLC檢測，結果藥材對照樣品有3個(gè)斑點(diǎn)出現，說(shuō)明其中至少含有3種生物堿；而所測Fu7樣品出現2個(gè)斑點(diǎn)，且它們的Rf值與藥材提取物中的兩個(gè)點(diǎn)基本相同。因此，樣品中應該含有與平貝母中相同或相似的生物堿，對該菌我們還將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

　�。蹍⒖嘉墨I］

　　1 國家環(huán)境保護局，中國科學(xué)院植物研究所.中國珍稀瀕危植物名錄.北京：科學(xué)出版社，1987，197-200.

　　2 郭良棟.內生真菌研究進(jìn)展.菌物系統，2001，20（1）：148-152.

　　3 劉蕓，殷紅，彭輝，等.植物內生真菌—潛在的天然藥物新來(lái)源.中華現代中西醫雜志，2005，3（5）：404-405.

　　4 上海藥物研究所.中草藥有效成分的提取和分離.上海：上海人民出版社，1972，179-180.

　　5 陳業(yè)高.植物化學(xué)成分.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004，275.

　　6 趙得永.4種川貝母的總皂甙、總生物堿及西貝素的含量測定.中國中藥雜志，1994，19（2）：71-73.

　　作者單位： 710069 陜西西安，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

　�。壅�要］ 目的 從平貝母植株中分離內生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規微生物學(xué)方法分離出其中的內生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對這些真菌的提取物進(jìn)行生物堿定性檢測；再對陽(yáng)性樣品進(jìn)行TLC分析，并與藥材提取物進(jìn)行比較。結果 從平貝母幼苗中共分離出9種內生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應中都呈陽(yáng)性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現兩個(gè)與藥材樣品有相同Rf值的斑點(diǎn)。結論 該內生真菌菌株應具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

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