免疫組化技術(shù)的標準化質(zhì)控管理

【關(guān)鍵詞】  免疫組織化學(xué)；病理學(xué),臨床；質(zhì)控管理
免疫細胞學(xué)是免疫學(xué)與細胞化學(xué)相結合的一個(gè)分支學(xué)科，它是在免疫學(xué)理論基礎上利用抗原與抗體的特異性反應，在細胞或組織中定位抗原或抗體。免疫組化技術(shù)是用標記物或顯色物標記的抗體檢測細胞和組織內的抗原，從而達到診斷和研究疾病的目的。隨著(zhù)免疫組織化學(xué)技術(shù)在臨床病理研究與診斷中的廣泛應用，因其反應步驟多，影響因素復雜，質(zhì)量控制已被越來(lái)越多的病理技術(shù)專(zhuān)家重視。2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應用研討會(huì )上提出將質(zhì)控應用到免疫組化技術(shù)上。本文對免疫組化技術(shù)的標準化質(zhì)控管理進(jìn)行了探索，現介紹如下。
　　1  標本的固定
    
　　為了更好地保持細胞和組織原有的形態(tài)結構，防止組織自溶，必須對標本進(jìn)行固定。標本固定的好壞是影響病理診斷的關(guān)鍵，同樣也影響免疫組化的結果，所以固定是質(zhì)控的首要也是關(guān)鍵步驟。影響標本固定主要因素有以下幾點(diǎn)。①標本離體后固定不及時(shí)：一般離體標本要求15 min內必須固定[1]，最好是在手術(shù)室由專(zhuān)業(yè)的護士將離體的標本用清水沖洗干凈后立即放入質(zhì)量濃度40 g/L中性甲醛內，固定液的用量為標本體積的5～10倍。而目前本院手術(shù)室做不到這一點(diǎn)，這就要求病理技術(shù)員在接到標本后要及時(shí)固定，不能延誤時(shí)間。但是在手術(shù)室和路上延誤的時(shí)間不能控制。因此，呼吁臨床醫生應和病理科聯(lián)合起來(lái)，將標本固定地點(diǎn)放在手術(shù)室，以使標本及時(shí)固定，減少因固定不及時(shí)而出現的診斷困難。②標本固定的時(shí)間：40 g/L中性甲醛滲透速度一般是2 mm/h，隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)速度會(huì )逐漸減慢，增加濃度反而會(huì )降低滲透速度。一般手術(shù)標本用40 g/L中性甲醛固定的時(shí)間以12～24 h為佳，最長(cháng)不要超過(guò)72 h；如穿刺標本可用AFF液固定2～4 h。有研究顯示，用40 g/L中性甲醛固定1周后的標本，其組織抗原幾乎不能被檢出[1]。但是，日常工作中常常會(huì )遇到有人催發(fā)病理報告的情況，他們希望病理科的報告最好像檢驗科那樣早晨送下午就能拿到。這種情況下只有縮短制片程序，包括固定時(shí)間，這種操作只會(huì )增加病理診斷的風(fēng)險，埋下誤診的隱患。③固定液的種類(lèi)及濃度不恰當：免疫組化檢測常用的固定液有40 g/L中性甲醛、40 g/L鈣?甲醛、40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液等。穿刺標本可用AFF液固定。固定液濃度過(guò)高、過(guò)低都會(huì )因組織固定差而導致組織抗原丟失或易出現非特異性背景染色，從而影響免疫組化結果。EDTA是用于骨組織脫鈣的螯合劑，因在脫鈣過(guò)程中對組織的破壞性小而得到廣泛使用，缺點(diǎn)是脫鈣時(shí)間太長(cháng)。④標本固定時(shí)處理不當：如淋巴結組織往往因包膜沒(méi)切開(kāi)，影響了固定液的滲透，而使組織固定差。大標本因沒(méi)切開(kāi)固定，而使標本固定不勻等，都可影響免疫組化染色。我們接診了很多低級別醫院來(lái)會(huì )診標本，都存在以上問(wèn)題，因固定差而直接影響免疫組化結果及診斷。
　　2  切片與烤片
    
　　免疫組化檢測的切片厚以3～4 μm為宜，淋巴結組織可行2 μm厚切片，太厚影響染色結果和診斷。因免疫組化反應步驟多，易出現脫片現象，需要將載玻片處理后方可使用。處理方法：先將載玻片用肥皂水洗凈后，放入清潔液中浸泡12～24 h，清水沖洗2 h，蒸餾水洗5遍，體積分數0.95乙醇浸泡后，用干凈的綢布擦干，再掛膠。掛膠方法有很多種，如： APES、鉻礬明膠液、多聚賴(lài)氨酸等。切片裱片要完整，不能有氣泡，烤片時(shí)溫度不能過(guò)高，65 ℃烤30 min即可進(jìn)行染色�？酒瑫r(shí)間過(guò)短易造成脫片，溫度過(guò)高或過(guò)長(cháng)可破壞抗原。
　　3  減少或消除非特異性染色
    
　　組織中非抗原抗體反應出現的陽(yáng)性染色稱(chēng)為非特異性背景染色。最常見(jiàn)的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上。常見(jiàn)的消除方法有：①在滴加第一抗體前用體積分數0.02～0.05山羊血清或牛血清封閉組織上帶電荷基團，而除去與第一抗體的非特異性結合。此種方法一般用于不需抗原修復的抗體或內源性生物素較高的組織效果佳。②體積分數0.03～0.06過(guò)氧化氫法是目前最常用的方法之一，我們認為體積分數0.05過(guò)氧化氫處理10～15 min的效果較好。③洗滌過(guò)程中用高鹽緩沖液沖洗切片，也是消除非特異性染色的方法之一。方法是將磷酸緩沖液中加入10 g/L的氯化鈉（pH 7.4）。④稀釋抗體濃度，但必須通過(guò)陽(yáng)性對照來(lái)掌握稀釋的最佳濃度。我們的實(shí)踐證明，應用北京中杉試劑公司生產(chǎn)的PV?9000二步法試劑盒，可有效地避免內源性生物素造成的非特異性染色，且操作簡(jiǎn)便。4  抗原修復
    
　　免疫組化在病理學(xué)上的應用常因甲醛固定等因素影響造成抗原失活。解決因固定包埋導致抗原失活的問(wèn)題有3個(gè)途徑：①開(kāi)發(fā)新型抗體以識別甲醛固定后的組織抗原或提高免疫組化試劑的靈敏度；②用改良固定液取代甲醛；③挽救因甲醛固定而失活的抗原，即抗原修復。而后者因方法簡(jiǎn)單而增敏效果顯著(zhù)，在病理技術(shù)中得到廣泛應用�？乖�修復是影響染色結果的最關(guān)鍵因素，目前最常用的是加熱煮沸法，少數用酶消化法。加熱抗原修復是1991年由SHI等最先報道，其機制是通過(guò)加熱打開(kāi)了組織抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交聯(lián)。修復的方法有高壓法、微波法、水浴法等。英聯(lián)邦免疫細胞化學(xué)室間質(zhì)控組織（UK NEQAS?ICC）進(jìn)行的有105家實(shí)驗室參與、歷時(shí)兩年的研究結果顯示，ER、PR染色偏弱是由于微波加熱時(shí)間不足與實(shí)驗中操作控制不當所致，強烈推薦使用高壓抗原修復[2]。國內也有專(zhuān)家研究表明，目前抗原修復最突出和最頑固的問(wèn)題是修復不夠。各種修復方法染色強度比較，高壓法>水浴法>微波法�？乖�修復液常用的有枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、EDTA緩沖液（pH 8.0～9.0）等。在2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應用研討會(huì )上周小鴿教授做了以下實(shí)驗（圖1）：A類(lèi)抗原在任何pH條件下，修復效果都很好；B類(lèi)抗原在低和高pH時(shí)，修復效果好，但在中等pH時(shí)，修復效果很差；C類(lèi)抗原隨著(zhù)pH的增高，修復結果越來(lái)越好。如果實(shí)驗室只想用1種修復液，又能兼顧3類(lèi)抗原，就可選擇圖中3條曲線(xiàn)最靠近的區域所對應的pH值，此處所對應的pH為8.0～9.0。因此，他認為高pH修復液比低pH修復液更好。我們認為高壓修復具有壓力穩定、受熱均勻、陽(yáng)性檢出率和陽(yáng)性強度高、背景著(zhù)色少等優(yōu)點(diǎn)，對核染色陽(yáng)性的抗原用pH 9.0的EDTA修復液效果較好，胞漿胞膜染色陽(yáng)性的用pH 8.0的EDTA抗原修復液修復的效果較好，但如果采用pH 9.0的EDTA在高壓修復時(shí)易脫片。高壓修復的方法是：先將高壓鍋內的修復液煮沸，將切片放入高壓鍋內，將壓力加熱至最大（105 kPa）1～2 min,加熱功率不要大于1 000 W。有研究表明，Ki67與P53在使用電磁爐加熱時(shí)，隨著(zhù)功率的增強，陽(yáng)性強度反而減弱。我們認為只要功率在800 W左右，不管是電磁爐還是電爐加熱對免疫組化的結果影響都不大。
　　5  標準化實(shí)驗對照
    
　　免疫組化對照實(shí)驗的設立在免疫組化標準化中是極其必要的。隨著(zhù)病人法律意識的不斷增強，醫患之間的矛盾越來(lái)越大，病理醫師的診斷風(fēng)險也越來(lái)越大。這就要求醫生對染色結果要有正確判斷，同時(shí)也對病理技術(shù)人員提出了設立陽(yáng)性和陰性對照的要求，這不但是對病人負責，也是保護自己的一種方式。陰性對照是用確定不含有待測抗原的組織作為陰性對照組織，陽(yáng)性對照是對照組織中含有已知的抗原[3]。我們認為在日常工作中設置陽(yáng)性對照最關(guān)鍵，通常是用闌尾來(lái)做陽(yáng)性對照組織，因為闌尾中含有多種組織成分如上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。
　　圖1  3種抗原不同pH條件下修復效果（略） 
　　總之，要做出好的免疫組化結果，除了要求病理技術(shù)人員掌握豐富的理論知識外，還要求有較強的責任心，嚴格按標準化、規范化操作，只有這樣才能更好地將免疫組化技術(shù)應用于臨床，服務(wù)于病人。
   
【參考文獻】
  　　[1]王小亞,崔全才. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社, 2007：47.

　　[2]王伯沄. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社, 2007：19?20.

　　[3]王伯沄, 李玉松. 病理學(xué)技術(shù)[M]. 北京：人民衛生出版社, 2001：365.

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