微生物檢驗必須掌握的三大耐藥機制

　　你知道什么是微生物檢驗嗎?你對微生物檢驗了解嗎?下面是yjbys小編為大家帶來(lái)的關(guān)于微生物檢驗必須要知道的三大耐藥機制的知識，歡迎閱讀。

　　一、產(chǎn)生滅活抗生素的各種酶

　　1、 β—內酰胺酶(β-lactamase)

　　β—內酰胺類(lèi)抗生素都共同具有一個(gè)核心β—內酰胺環(huán)，其基本作用機制是與細菌的青霉素結合蛋白結合，從而抑制細菌細胞壁的合成。產(chǎn)生β—內酰胺酶是細菌對β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。細菌產(chǎn)生的β-內酰胺酶，可借助其分子中的絲氨酸活性位點(diǎn)，與β—內酰胺環(huán)結合并打開(kāi)β—內酰胺環(huán)，導致藥物失活。迄今為止報道的β—內酰胺酶已超過(guò)300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶;第2型為能被克拉維酸抑制的β-內酰胺酶;第3型為不被所有β—內酰胺酶抑制劑抑制的金屬β-內酰胺酶(需Zn2+活化)�？杀灰叶�胺四乙酸和P-chloromercuribenzate所抑制;第4型為不被克拉維酸抑制的青霉素酶。臨床常見(jiàn)的β—內酰胺酶有超廣譜β—內酰胺酶、頭孢菌素酶(AmpC酶)和金屬酶。

　　(1)超廣譜β-內酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)

　　ESBLs是一類(lèi)能夠水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及單環(huán)類(lèi)抗生素的β—內酰胺酶，屬Bush分型中的2型β—內酰胺酶，其活性能被某些β—內酰胺酶抑制劑(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-內酰胺酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突變而來(lái)，其耐藥性多由質(zhì)粒介導。自1983年在德國首次發(fā)現ESBLs以來(lái)，目前已報道的TEM類(lèi)ESBIs已有90多種，SHV類(lèi)ESBLs多于25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發(fā)現于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發(fā)現于變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸桿菌科細菌。

　　國內近年來(lái)隨著(zhù)三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌的檢出率逐年增加。NCCLs規定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應監測是否為產(chǎn)ESBLs菌株;若產(chǎn)生，無(wú)論體外對第三代頭抱菌素、氨曲南的藥敏結果如何，均應報告對三代頭孢菌素及氨曲南耐藥。另外，ESBLs菌株不僅對β-內酰胺類(lèi)抗生素有很高的耐藥率，而且對氨基糖苷類(lèi)、喹喏酮類(lèi)耐藥率也在60%左右，因此，臨床遇到由ESBLs引起的感染時(shí)，建議首選含β—內酰胺酶抑制劑的復方抗生素制劑或亞胺培南;對于頭孢吡肟等四代頭孢，尚有爭議，根據抗菌藥的PK/PD理論，適當改變給藥劑量和給藥間隔。以使血藥濃度超過(guò)細菌MIC的時(shí)間達40%給藥間隔以上，或許是有效的。

　　(2)頭孢菌素酶(AmpC酶)屆Bush分類(lèi)中的1型(Ⅰ型) β—內酰胺酶。

　　通常將其分為由染色體介導產(chǎn)生的AmpC β—內酰胺酶和由質(zhì)粒介導產(chǎn)生的AmpC β—內酰胺酶，前者的產(chǎn)生菌有陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌產(chǎn)生。AmpC酶可作用于大多數青霉素，第一、二、三代頭孢菌素和單環(huán)類(lèi)抗生素。而第四代頭孢菌素、碳青霉烯類(lèi)不受該酶作用。該酶不能被β—內酰胺酶抑制劑所抑制。AmpCβ—內酰胺酶的產(chǎn)生有2種可能：①在誘導劑存在時(shí)暫時(shí)高水平產(chǎn)生，當誘導劑不存在時(shí)，酶產(chǎn)量隨之下降，三代頭孢菌素、棒酸和碳青霉烯類(lèi)抗生素是誘導型AmpC酶的強誘導劑;②染色體上控制酶表達的基因發(fā)生突變，導致AmpC酶持續穩定高水平表達。由高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌引起的感染死亡率很高。

　　實(shí)際上，所有的革蘭氏陰性菌都能產(chǎn)生染色體介導的AmpC頭孢菌素酶，在多數情況下為低水平表達;在腸桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷氏菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導產(chǎn)生，且常為高產(chǎn)突變株。當臨床出現上述細菌感染，開(kāi)始幾天三代頭孢菌素治療敏感，而隨后發(fā)生耐藥時(shí)，我們可懷疑為高產(chǎn)AmpC酶的細菌感染，四代頭孢菌素和碳青霉烯類(lèi)抗生素不受具影響，可供臨床選用。含酶抑制劑的復方制劑不能用于治療產(chǎn)AmpC酶菌株的感染。

　　(3)金屬酶(metalloβ-1actamase)

　　大部分β-內酰胺酶的活性位點(diǎn)是絲氨酸殘基，但也有一小部分活性位點(diǎn)為金屬離子的酶類(lèi)。第一個(gè)發(fā)現的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱桿菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶，能被EDTA所抑制，之后世界各地均發(fā)現了能產(chǎn)生這類(lèi)酶的各種細菌。1988年Bush首次將該酶定名為金屬β-內酰胺酶(metalloβ-1actamase)，簡(jiǎn)稱(chēng)金屬酶。金屬β-內酰胺酶耐受β—內酰胺酶抑制劑且可水解幾乎所有β—內酰胺類(lèi)抗生素(包括亞胺培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發(fā)現，其中嗜麥芽窄食單胞菌的亞胺培南耐藥性由染色體介導，而脆弱擬桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導的突變株在日本已有報道。由粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的金屬β—內酰胺酶IMP-1型可在類(lèi)似接合子的intl3上移動(dòng)，已經(jīng)傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)堿桿菌。金屬酶可以水解碳青霉烯類(lèi)和最近開(kāi)發(fā)的第四代頭孢菌素。金屬β-內酰胺酶有廣泛傳播的潛力，對幾乎所有的β—內酰胺類(lèi)抗生素均具有水解活性，是目前所知的最強的β-內酰胺酶-。

　　2、氨基糖甙修飾酶(或鈍化酶/滅活酶)

　　在細菌對氨基糖甙類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥的機制中，修飾酶介導的耐藥最為流行，酶促修飾的氨基糖甙類(lèi)抗生素不能與核糖體靶位作用，因此失去抗菌活性。修飾酶主要包括乙酰轉移酶、磷酸轉移酶和核苷轉移酶。三類(lèi)氨基糖苷修飾酶的作用機制各不相同：乙酰轉移酶(AAC)修飾依賴(lài)于乙酰輔酶A的N-乙�；�：磷酸轉移酶(APH)修飾依賴(lài)于A(yíng)TP的O-磷酸化;核苷酸轉移酶(ANT)修飾依賴(lài)于A(yíng)TP的腺苷化。在革蘭氏陰性病原菌中，最常見(jiàn)的氨基糖苷修飾酶是AAC(6’)，使氨基糖苷類(lèi)抗生素1—、3—、2’—或6'—位乙�；�，如今已發(fā)現16種編碼AAC(6’)的基因。銅綠假單胞菌和腸桿菌科細菌趨向于產(chǎn)生AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);葡萄球菌和糞腸球菌經(jīng)常產(chǎn)生ANT(4’)(4’’)或雙功能的AAC(6’)/APH(2”)。葡萄球菌對慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素的耐藥性和腸球菌的高度慶大霉素耐藥性通常由雙功能酶介導，這些酶通常(但非總是)由位于多重耐藥質(zhì)粒上的轉座子(Tn924)編碼，如葡萄球菌具有的轉座子Tn5405編碼的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐藥性)，而其他的定位于染色體。越來(lái)越多的菌株可產(chǎn)生2種或更多種酶，對抗氨基糖苷類(lèi)抗生素。在過(guò)去幾年里常見(jiàn)的組合是慶大霉素修飾酶ANT(2’’)和AAC(3)]與AAC(6’)結合，導致對慶大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的廣譜耐藥性。

　　氨基糖苷類(lèi)抗生素對非發(fā)酵菌、腸桿菌科及一些革蘭氏陽(yáng)性球菌均有很好的抗菌活性，與β—內酰胺類(lèi)抗生素聯(lián)用有協(xié)同抗菌作用，在感染治療中占有重要地位。但由于以上耐藥機制的存在，細菌耐藥問(wèn)題也日趨嚴重，應該引起重視，可喜的是阿米卡星等對MRSA和產(chǎn)ESBLs菌株仍保持17%-40%的敏感率。

　　二、改變藥物作用靶位

　　1、 青霉素結合蛋白(PBP)的改變導致的β—內酰胺類(lèi)抗生素耐藥

　　青霉素結合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最后階段。高分子量PBP常常為多模塊，具有N末端糖基轉移酶區和C末端轉肽酶區。轉肽酶區的活性位點(diǎn)絲氨酸與酶的天然結構相仿，可與與β—內酰胺類(lèi)抗生素發(fā)生不可逆�；�。青霉素結合蛋白(PBP)的改變常導致如下兩種臨床重要的耐藥表型。

　　(1)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus,MRSA)

　　MRSA是20世紀60年代英國首先報道的一種嚴重的臨床耐藥致病菌,20世紀80年代以來(lái)，世界各地都相繼發(fā)生MRSA醫院感染的暴發(fā)流行，并逐年增多。MRSA耐藥分為固有耐藥和獲得性耐藥，固有耐藥是由染色體介導的，其耐藥性的產(chǎn)生是因為細菌產(chǎn)生一種特殊的青霉素結合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量為78000的蛋白質(zhì)，與β內酰胺類(lèi)抗生素的親和力減低，從而導致細菌對β-內酰胺類(lèi)抗生素耐藥。PBP2a由mecA基因編碼，95%以上的MRSA菌株能檢測到mecA基因，而敏感株則無(wú)。獲得性耐藥是由質(zhì)粒介導的，細菌獲得耐藥基因后，產(chǎn)生大量β-內酰胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青霉素緩慢失活，表現出耐藥性，多為臨界耐藥。

　　在MRSA檢測過(guò)程中，凡屬MRSA，不管其對其他β-內酰胺類(lèi)抗生素MIC值或抑菌圈的大小，實(shí)驗室均應向臨床報告為對所有青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、碳頭孢烯類(lèi)和β內酰胺類(lèi)—酶抑制劑復合制劑耐藥，以免誤導臨床用藥。MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題之一，關(guān)鍵是其對許多抗生素具有多重耐藥性，萬(wàn)古霉素是目前臨床上治療MRSA療效肯定的抗生素，應用30多年來(lái)未發(fā)現耐藥菌株。

　　(2) 耐青霉素肺炎鏈球菌 (Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)

　　長(cháng)期以來(lái)肺炎鏈球菌對青霉素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之間。1967年澳大利亞首次報道耐青霉素肺炎鏈球菌,MIC為0.5mg/L，此后世界許多國家和地區均有報道，且耐藥率迅速上升。PRSP的耐藥機制肺炎鏈球菌的青霉素結合蛋白(PBP)發(fā)生改變，使其與青霉素的親和力減低。肺炎鏈球菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，如果青霉素結合到PBP2b上并使之抑制即導致細菌溶解和死亡;反之，PBP2b發(fā)生突變，青霉素不能產(chǎn)生作用，則導致PRSP。在PRSP高耐菌株中(MIC≥2μg/m1)可有多達4種PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同時(shí)發(fā)生改變[7]。

　　肺炎鏈球菌是引起社區獲得性肺炎的重要致病菌。目前，國內PRSP的發(fā)生率在4%左右，明顯低于歐洲國家，在亞洲也屬于中等水平，且MIC多小于1mg/L，因此，在社區獲得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不構成嚴重威脅，青霉素仍可作為首選治療藥物。但是耐藥沒(méi)有國界，中國日前PRSP發(fā)生率尚低.但決不意味著(zhù)不要重視，而是應該進(jìn)一步加強PRSP的耐藥監測。對于PRSP感染臨床治療推薦使用頭孢噻肟/頭孢曲松、新喹諾酮類(lèi)(如司帕沙星)。若屬PRSP嚴重感染則需應用萬(wàn)古霉素或加用利福平。

　　2、 DNA拓撲異構酶的改變引起喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥

　　喹諾酮類(lèi)藥物的作用機制主要是通過(guò)抑制DNA拓撲異構酶而抑制DNA的合成，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用。細菌DNA拓撲異構酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹諾酮類(lèi)藥物的主要作用靶位是拓撲異構酶Ⅱ和拓撲異構酶Ⅳ。拓撲異構酶Ⅱ又稱(chēng)DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的形成，拓撲異構酶Ⅳ則參與細菌子代染色質(zhì)分配到子代細菌中。革蘭氏陰性菌中DNA促旋酶是喹諾酮類(lèi)的第一靶位，而革蘭氏陽(yáng)性菌中拓撲異構酶Ⅳ是第一靶位。

　　當編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓撲異構酶Ⅳ的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可引起喹諾酮類(lèi)的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變?yōu)橹�，�?0%左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有這些突變類(lèi)型中，若Ⅱ型拓撲異構酶上存在2個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA和parC上)，它們引起對氟喹諾酮類(lèi)的耐藥遠遠大于只有一個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同時(shí)沒(méi)有發(fā)現突變僅出現在parC基因這一現象。這可能是因為DNA促旋酶是氟喹諾酮類(lèi)的重要靶位,gyrA亞單位的改變可引起酶結構發(fā)生變化致空間位障，阻止喹諾酮類(lèi)進(jìn)入喹諾酮類(lèi)作用區，或引起物理化學(xué)變化，干擾喹諾酮與酶的相互作用。這些結果顯示gyrA上突變的出現是引起細菌對喹諾酮類(lèi)發(fā)生耐藥的主要機制，而parC突變只是進(jìn)一步引起銅綠假單胞菌對喹諾酮的高度耐藥。

　　DNA拓撲異構酶的改變是細菌耐喹諾酮類(lèi)抗菌藥的主要機制，其他耐喹諾酮類(lèi)的機制還包括后面將要談到的細菌膜通透性改變和主動(dòng)外排機制。

　　三、細胞膜透性屏障和抗生素主動(dòng)外排泵

　　細菌可以通過(guò)細胞壁的障礙或細胞膜通透性的改變，形成一道有效屏障，使得抗生素無(wú)法進(jìn)入細胞內并達到作用靶位而發(fā)揮抗菌效能，這也是細菌在進(jìn)化與繁殖過(guò)程中形成的一種防衛機制。這類(lèi)耐藥機制是非特異性的，主要見(jiàn)于革蘭氏陰性菌。因為革蘭氏陰性菌細胞壁粘肽層外面存在著(zhù)類(lèi)脂雙層組成的外膜，外層為脂多糖，由緊密排列的碳氮分子組成，阻礙了疏水性抗菌藥進(jìn)入菌體內。另外細菌外膜上還存在著(zhù)多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可形成特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營(yíng)養物質(zhì)和親水性抗菌藥物的通道�？咕�藥物分子越大，所帶負電荷越多，疏水性越強，則不易通過(guò)細菌外膜。細菌發(fā)生突變失去某種特異孔蛋白后即可導致細菌耐藥性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使藥物不易通過(guò)而產(chǎn)生耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺失即導致碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥。

　　另外一種導致細菌非特異性耐藥的機制是細菌主動(dòng)外排泵的存在，可以將進(jìn)入細菌體內的藥物泵出膜外，從而逃避抗生素的作用。主動(dòng)外排系統由于能特異地將進(jìn)入細胞內的多種抗菌藥物主動(dòng)泵出細胞外，導致細胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多藥外排泵AcorAB-TolC系統可以導致細菌對包括四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、β—內酰胺類(lèi)、利福平、氟喹諾酮類(lèi)、氧化劑、有機溶劑、堿性染料等多種結構不相關(guān)的藥物耐藥。銅綠假單胞菌的MexAB-OprM系統的主動(dòng)外排作用也是導致銅綠假單胞菌固有的多重耐藥性的重要因素之一。

　　細菌的膜耐藥機制主要表現在銅綠假單胞菌的多藥耐藥性。銅綠假單胞菌幾乎囊括了包括膜耐藥在內的所有細菌耐藥機制，其耐藥已成為當前感染治療中較為棘手的問(wèn)題之一，尤其值得重視和研究。

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