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幾種典型植物精油的化學(xué)成分與其抗菌活性論文
近年來(lái)，環(huán)保法規日益嚴格，人類(lèi)更加注重健康，崇尚自然。在這種形勢下，研發(fā)一些新型的天然、低毒的抗菌劑成了國內外抗菌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。植物精油，因其萃取自天然植物，同時(shí)又具有廣譜的抗菌活性，日益受到國內外專(zhuān)家學(xué)者的關(guān)注，植物精油抗菌活性及其機制的研究也成了一個(gè)比較活躍的研究領(lǐng)域。
植物精油又稱(chēng)揮發(fā)油或香精油，是萃取植物特有的芳香味兒油狀液體，取自于草本植物的花、苞、葉、枝、根、樹(shù)皮、果實(shí)、種子和樹(shù)脂等，以蒸餾和壓榨等方式提煉出來(lái)。研究報道稱(chēng)，植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能夠抑殺細菌、真菌和病毒[4-…。而且，植物精油能夠影響微生物各個(gè)階段的生長(cháng)：生長(cháng)延滯期延長(cháng)，指數生長(cháng)期的生長(cháng)速率下降，總的細胞生長(cháng)數量降低。除此之外，一些研究表明，植物精油能夠抑制真菌毒素的產(chǎn)生，如Sindhu等[11]報道了姜黃(CWcm腫longaL.)葉油能夠抑制黃曲霉的生長(cháng)，并抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，Rassoli和Owlia報道了百里香屬(7%_y臟^1)的T.eriocalyx和T.X-porlock兩種精油也能夠抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。本文選擇了香茅(Cymbopogoncitrates)精油、山蒼子治eacu-beba)精油、肉桂(O.刪amomumzeylanicum)精油、丁香(《Syzyg.Umaromatic勵)精油、迷迭香(Rosmarinuso^cinato)精油和大蒜(乂Wiumsati-ram)精油等6種典型植物精油，通過(guò)GC-MS分析了它們的化學(xué)成分，研究了它們對革蘭氏陰性的大腸桿菌(Escherichiacoli)和革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗細菌活性，以及對黑曲霉(Aspergillusniger)和繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)這兩種典型的常見(jiàn)污染霉菌的抗真菌活性，并探討了植物精油化學(xué)成分與抗菌活性之間的聯(lián)系。本研究選取了幾種典型的植物精油，對其化學(xué)組分、抗細菌和抗真菌活性，以及化學(xué)組分與抗菌活性之間的聯(lián)系開(kāi)展了較為系統的研究工作，該研究將為獲得具有高效抗菌活性的植物精油,開(kāi)發(fā)新型的植物精油抗菌劑提供重要的研究基礎。
1材料與方法
1.1菌株、培養基和精油
香茅精油、山蒼子精油、肉桂精油、丁香精油、迷迭香精油和大蒜精油均購自廣州百花香料股份有限公司，為純天然植物精油。
大腸桿菌ATCC8739,金黃色葡萄球菌ATCC6538均購自美國菌種保藏中心，由本實(shí)驗室保存；黑曲霉GIM3.412,繩狀青霉GIM3.103均購自廣東省微生物菌種保藏中心，由本實(shí)驗室保存。
MH(Muellerhinton)培養基、PDA(Potatodextroseagar)培養基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)驗所用MH瓊脂修飾培養基是在MH培養基中加入0.5%的Tween20和1.5%的瓊脂后高溫滅菌配制，PDA修飾培養基是在PDA培養基中加入0.5%的Tween20后經(jīng)高溫滅菌配制。
1.2實(shí)驗方法
1.2.1霉菌孢子懸液和細菌懸液的配制[13<5]:將黑曲霉和繩狀青霉分別接種到PDA斜面培養基中，置于恒溫培養箱中28°C培養7d。將培養好的黑曲霉和繩狀青霉斜面分別用滅菌的0.1%的Tween80洗脫孢子，將孢子懸液充分潤旋混勻，并用0.1%的Tween80分別稀釋至5x106CFU/mL(血球計數板計數)備用。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從MHA斜面上接種到MH培養基中，置于搖床上35°C振蕩培養2-4h至指數生長(cháng)期，分別取指數生長(cháng)期的菌液1mL,離心棄上清，PBS各洗滌1次，并用PBS重懸，分別稀釋至5x106CFU/mL(測OA^o調節菌濃度)備用。
1.2.2植物精油的氣質(zhì)聯(lián)用分析[1<H19]:6種植物精油通過(guò)美國ThermoFinnigan公司的TraceGC/DSQ氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析，所用色譜柱為DB-5ms(長(cháng)30mx直徑0.25mmx填充粒子直徑0.25^m)。色譜條件為：初始溫度為60°C,保持2min,之后以10°C/min的速度升溫至220°C,保持15min,載氣He,流速
1.0mL/min。程序升溫進(jìn)樣模式(PTV)分流進(jìn)樣，分流比為1:50。進(jìn)樣口溫度從初始70°C升溫至250°C。電離方式為EI,離子源溫度為200°C,四級桿掃描范圍30-450m/z,傳輸線(xiàn)溫度250°C。將樣品的質(zhì)譜圖與NIST質(zhì)譜庫中的標樣進(jìn)行比對，對化合物進(jìn)行試驗性的分析鑒定。
1.2.3植物精油的抗真菌活性研究(污染食物技術(shù)，Poisonedfoodtechnique)[15,17]:將PDA修飾培養基熔化后，將香茅、山蒼子、肉桂、丁香、迷迭香和大蒜精油等6種植物精油分別加入到PDA修飾培養基中，使每種植物精油均配制成如下濃度梯度(F/F):0,0.016%,0.031%,0.063%,0.125%,0.250%,0.5%,1%。取黑曲霉和繩狀青霉的孢子懸液(5x106CFU/mL)各100^L,分別加到平皿上(即每個(gè)平皿約5x105CFU),涂布均勻，每種精油每個(gè)濃度每種霉菌各做3個(gè)平行，帕拉膠膜將平皿邊緣封口，置于恒溫培養箱中28°C靜置培養28d,觀(guān)察統計實(shí)驗結果。
1.2.4植物精油的抗細菌活性研究(污染食物技術(shù))[15,17]:將MH瓊脂修飾培養基熔化后，將香茅、山蒼子、肉桂、丁香、迷迭香和大蒜精油等6種植物精油分別加入到MH瓊脂修飾培養基中，使每種植物精油均配制成如下濃度梯度(F/F):0、0.016%、0.031%、0.063%、0.125%、0.25%、0.5%、1%。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液(5x106CFU/mL)充分混勻后，各取100^L,分別加到平皿上（即每個(gè)平皿約5x105CFU),涂布均勻，每種精油每個(gè)濃度每種菌各做3個(gè)平行，置于恒溫培養箱中35°C培養7d,觀(guān)察統計實(shí)驗結果。
2結果與分析
2.16種植物精油的氣質(zhì)聯(lián)用化學(xué)組分分析根據氣質(zhì)聯(lián)用分析結果，6種植物精油的可
能化學(xué)組分見(jiàn)表1。由表1可以看出，肉桂精油的醛類(lèi)總含量約為87%,醇類(lèi)總含量約8%;山蒼子精油醛類(lèi)總含量約71%,醇類(lèi)總含量約4%;香茅精油的醇類(lèi)總含量約40%,醛類(lèi)總含量約38%;迷迭香精油醇類(lèi)總含量約54%,醛類(lèi)總含量不足1%;丁香精油的主要化學(xué)組分是丁香油酣，約占了總化學(xué)組分的85%。大蒜精油的化學(xué)組分比較特殊，基本上都是含硫的醚類(lèi)，其中二烯丙基三硫醚(大蒜素)含量最高，約占總的化學(xué)組分的30%。
2.26種植物精油的抗真菌活性
6種植物精油對黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制濃度（Minimuminhibitoryconcentration,MIC)見(jiàn)表2,從表2可以看出，肉桂精油的抗真菌活性最強，其次是大蒜精油、山蒼子精油、丁香精油和香茅精油，迷迭香精油的抗真菌活性最弱。肉桂精油對黑曲霉的實(shí)驗組處理1d時(shí)，黑曲霉對照即長(cháng)滿(mǎn)白色菌絲，黑曲霉的0.016%-1%處理組均沒(méi)有霉菌生長(cháng)跡象；處理
2d時(shí)，對照組已開(kāi)始長(cháng)了黑色孢子，0.016%-0.031%處理組已經(jīng)長(cháng)了白色菌絲，但未長(cháng)孢子，0.063%-1%處理組沒(méi)有霉菌生長(cháng)跡象;處理7d時(shí),對照組平皿已長(cháng)滿(mǎn)黑色孢子,0.016%-0.031%精油處理組也都長(cháng)了黑色孢子，0.063%-1%均沒(méi)有黑曲霉生長(cháng)；直到處理28d,
0.063%-1%精油處理組仍沒(méi)有黑曲霉生長(cháng)，因此肉桂精油對黑曲霉的最低抑制濃度處理7d和處理28d時(shí)均為0.063%。肉桂精油對繩狀青霉的實(shí)驗處理1d時(shí)，對照組即長(cháng)滿(mǎn)白色菌絲,0.016%-1%處理組均沒(méi)有繩狀青霉生長(cháng)跡象;處理2d時(shí)，對照組開(kāi)始長(cháng)了青色孢子，0.016%-0.031%處理組長(cháng)了白色菌絲，0.063%-1%處理組沒(méi)有繩狀青霉生長(cháng)；處理7d時(shí)，對照組長(cháng)滿(mǎn)青色孢子，0.016%-0.031%處理組也長(cháng)了青色孢子，0.063%-1%處理組沒(méi)有繩狀青霉生長(cháng)；直到處理28d時(shí)，0.063%-1%處理組均沒(méi)有霉菌生長(cháng)，因此，肉桂精油對繩狀青霉的最低抑制濃度處理7d和處理28d亦均為0.063%。
從表2可以看出，大蒜精油對黑曲霉的最低抑制濃度在處理7d和處理28d時(shí)分別為0.063%和0.125%,大蒜精油對繩狀青霉的最低抑制濃度在處理7d和28d時(shí)亦分別為0.063%和0.125%;丁香精油對黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制濃度在處理7d和處理28d時(shí)均為0.125%;山蒼子精油對黑曲霉的最低抑制濃度在處理7d和處理28d時(shí)分別為0.125%和0.25%,山蒼子精油對繩狀青霉的最低抑菌濃度在處理7d和處理28d時(shí)亦分別為0.125%和0.25%;香茅精油對黑曲霉的最低抑制濃度在處理7d和處理28d時(shí)分別為0.125%和0.25%,香茅精油對繩狀青霉的最低抑制濃度在處理7d和處理28d時(shí)亦分別為0.125%和0.25%;迷迭香精油對黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制濃度在處理7d時(shí)均為1%,處理28d時(shí)0.016%-1%處理組均沒(méi)能完全抑制黑曲霉和繩狀青霉的生長(cháng)。
2.16種植物精油的抗細菌活性
6種植物精油對兩種細菌的最低抑制濃度結果見(jiàn)表3,由表3可以看出，肉桂精油的抗細菌活性最強，其次是山蒼子精油和丁香精油,香茅和迷迭香的抗細菌活性較弱，而大蒜精油在0.016%-1%的處理濃度下沒(méi)有顯示出抗細菌活性。6種植物精油的實(shí)驗中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的對照組在處理1d時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別布滿(mǎn)平皿。肉桂精油對大腸桿菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)分別為0.016%和0.031%,肉桂精油對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)亦分別為0.016%和0.031%;山蒼子精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)均為0.125%;丁香精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)均為0.25%;香茅精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)均為1%;迷迭香精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度在處理1d和處理7d時(shí)均為1%;大蒜精油在0.016%-1%處理濃度下，沒(méi)能抑制住大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(cháng)。
3討論
根據植物精油抗菌活性實(shí)驗的結果，6種植物精油的抗真菌活性由強到弱依次為：肉桂精油>大蒜精油>丁香精油>山蒼子精油=香茅精油>迷迭香精油，抗細菌活性由強到弱依次為:肉桂精油>山蒼子精油>丁香精油>香茅精油=迷迭香精油>大蒜精油。
由此可以看出，肉桂精油的抗真菌和細菌活性最強，山蒼子和丁香精油的抗真菌和細菌活性也很高，大蒜和香茅兩種植物精油的抗真菌活性很強，但抗細菌活性較弱，尤其大蒜精油在實(shí)驗濃度下不能完全抑制細菌的生長(cháng)；迷迭香精油的抗真菌和細菌活性較弱。不同植物精油的抗真菌、細菌活性存在差異，其抗真菌、細菌活性強弱與其化學(xué)組分密切相關(guān)，據報道,植物精油組分抗微生物活性大小排序如下：酣類(lèi)(活性最高)>肉桂醛>醇類(lèi)>醛類(lèi)=酮類(lèi)>酯類(lèi)>碳氫化合物類(lèi)。本實(shí)驗中，肉桂、山蒼子、香茅、迷迭香精油都含有大量的醛類(lèi)和醇類(lèi),其高效的抗菌活性可能與醛和醇的抗菌活性相關(guān)，丁香精油的主要化學(xué)組分是丁香油酣，其較高的抗真菌、細菌活性也可能主要源于丁香油酣，此外，這5種精油中的一些微量成分也可能對抗菌活性起到了增效的作用；大蒜精油的主要化學(xué)組分為以大蒜素為主的含硫醚類(lèi),大蒜精油具有高效的抗真菌活性，但抗細菌活性較弱，可能某種含硫醚起到了主要的抗真菌作用，也可能是幾種含硫醚發(fā)揮了協(xié)同抗真菌作用。
從實(shí)驗結果還可看出，植物精油的抗真菌活性和抗細菌活性之間存在著(zhù)明顯的差異，大蒜精油的抗真菌活性和抗細菌活性差異很大,抗真菌活性很高，僅次于肉桂精油位列第二,而抗細菌活性卻最差；香茅精油的抗真菌活性和抗細菌活性差異也較大，抗真菌活性較強,抗細菌活性較弱；山蒼子精油和丁香精油的抗真菌活性也是略?xún)?yōu)于其抗細菌活性；肉桂精油的抗細菌活性略?xún)?yōu)于其抗真菌活性。據文獻報道，植物精油的抗真菌活性比抗細菌活性更強,且革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌更敏感。本實(shí)驗中大蒜、香矛、山蒼子、丁香精油都是抗真菌活性?xún)?yōu)于抗細菌活性，只有肉桂精油例外,但本實(shí)驗未發(fā)現肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性有顯著(zhù)差異。實(shí)驗中，金黃色葡萄球菌的精油處理組菌落數量有時(shí)會(huì )比大腸桿菌要少一些，但是精油對兩種細菌的最低抑制濃度沒(méi)有明顯差異，因而從本實(shí)驗不能得出革蘭氏陽(yáng)性菌對植物精油更敏感的結論。本文只發(fā)現了植物精油的抗真菌活性與抗細菌活性之間存在差異，未發(fā)現對黑曲霉和繩狀青霉兩種不同真菌的抗菌活性之間的差異，也未發(fā)現對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種不同細菌的抗菌活性之間存在差異。由此，實(shí)驗結果表明植物精油很可能具有不同的抗真菌和抗細菌的機制，有關(guān)植物精油的抗真菌和抗細菌機制有待進(jìn)一步的研究與分析。此外，大蒜精油和香茅精油的抗真菌活性很高，而抗細菌活性不明顯,將會(huì )在細菌發(fā)酵領(lǐng)域有潛在的應用價(jià)值，能夠抑制細菌發(fā)酵中的真菌污染等。
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