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高氧對肺損傷患兒的影響研究

時(shí)間:2024-05-13 05:34:35 生命畢業(yè)論文 我要投稿
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高氧對肺損傷患兒的影響研究

  氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法,但是長(cháng)時(shí)間高濃度吸氧可導致肺損傷,下面是小編搜集的一篇關(guān)于高氧對患兒肺損傷影響探究的論文范文,供大家閱讀參考。

高氧對肺損傷患兒的影響研究

  近年隨著(zhù)科技的進(jìn)步,越來(lái)越多的極度早產(chǎn)兒和極低出生體質(zhì)量?jì)盒掖嫦聛?lái),但是由于長(cháng)期吸入高濃度氧,患兒可發(fā)生肺損傷,嚴重者甚至發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1,2].目前,高氧性肺損傷的機制尚不清楚,最近研究的熱點(diǎn)主要集中在氧化應激方面[3,4],而NAD+依賴(lài)性的組蛋白去乙;(SIRT1)在氧化應激及DNA損傷修復中發(fā)揮重要作用[5].本研究在前期實(shí)驗基礎上,通過(guò)建立高氧損傷人肺泡上皮細胞(HPAEC)模型[6],探討SIRT1轉位是否介導肺泡上皮細胞發(fā)生凋亡,從而為減輕高氧肺損傷尋找新的治療靶點(diǎn)。

  1材料與方法

  1.1細胞、儀器及試劑HPAEC細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。LX71型倒置相差顯微鏡購自Olympus公司,FORMA311型CO2培養箱、胎牛血清、DMEM高糖培養基購自Gibco公司,ANNEXINV流式細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司,單克隆小鼠抗SIRT1抗體購自博士德生物公司,羅丹明標記山羊抗小鼠IgG購自ZSGB-BIO公司,DAPI購自碧云天生物公司,抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物公司,單克隆小鼠抗SENP1抗體與單克隆抗乙;痯53lys(382)抗體購自Abcam公司,ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

  l.2HPAEC細胞培養先將HPAEC細胞復蘇,加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養液,放入37℃、含5%CO2培養箱中培養。待細胞生長(cháng)至對數生長(cháng)期時(shí),用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化,傳代培養。

  1.3HPAEC細胞分組及高氧干預取對數生長(cháng)期的細胞,消化后傳代接種于培養瓶中,隨機分為高氧組、對照組。對照組不作處理,放置于50mL/LCO2培養箱中培養;高氧組換液1次后,以3L/min的速度通入含900ml/LO2和50mL/LCO2高純混合氣,通入時(shí)間為10min,參照我們前期高氧模型建立的方法[6].分別培養24h(高氧組細胞干預24h后,使用測氧儀檢測培養瓶中氧濃度,如果氧濃度<90%則棄去該標本),之后收集HPAEC細胞。

  1.4HPAEC細胞凋亡情況觀(guān)察兩組細胞培養24h后,收集細胞,用流式細胞儀檢測,按照凱基ANNEXINV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

  1.5HPAEC細胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)學(xué)變化,并照相。

  1.6HPAEC細胞SIRT1蛋白轉位情況觀(guān)察將HPAEC細胞消化后,按細胞密度為2×104/孔接種于6孔板中蓋玻片上培養,同步化細胞,兩組均加入1mL培養基,高氧組另通入高濃度氧,分別培養24h;多聚甲醛固定細胞10min;0.3%TritonX-100打孔10min;5%封閉血清在37℃封閉30min;將稀釋的抗體SIRT1(終濃度為1∶100)滴加在細胞爬片上,4℃冰箱孵育過(guò)夜,在避光情況下將羅丹明標記的山羊抗小鼠IgG(終濃度為1∶50),37℃濕盒中孵育60min;用PBS洗滌3次,滴加DAPI復染,免疫共聚焦顯微鏡下觀(guān)察并照相;每張細胞爬片截取5個(gè)視野,每組8張爬片,并照相,計算細胞轉位率。

  1.7HPAEC細胞SENP1、乙;痯53蛋白檢測采用Westernblotting法。兩組細胞培養干預24h(細胞生長(cháng)80%融合),胰酶消化后PBS沖洗,離心并移去上清。加入200μL裂解混合液,冰浴30min,離心取上清,電泳、轉膜,加入一抗,再加入顯色的二抗,以TBST清洗,使用ECL進(jìn)行結果的顯影,然后用Labworks4.6分析目的條帶的灰度值。

  1.8統計學(xué)方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以x±s表示,組間比較采用t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學(xué)意義。

  2結果

  高氧組和對照組細胞凋亡率分別為24.77%±2.17%、5.33%±2.60%,兩組比較,P<0.05.高氧組細胞從正常的長(cháng)梭形、多角形變成圓形、橢圓形,細胞間的間隙增寬,懸浮的細胞較多;對照組細胞大多為長(cháng)梭形、多角形,貼壁較好,細胞間的間隙較小,懸浮的細胞較少。高氧組和對照組細胞SIRT1蛋白轉位率分別為88.89%(96/108)、16.23%(25/154),兩組比較,P<0.05.高氧組和對照組細胞SENP1蛋白相對表達量分別為0.76±0.12、0.67±0.02,乙;痯53蛋白相對表達量分別為0.81±0.07、0.52±0.03,兩組比較,P均<0.05.

  3討論

  近年來(lái),早產(chǎn)兒的出生率逐年增高,早產(chǎn)兒中大部分會(huì )發(fā)生夭折,氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方法,但是長(cháng)時(shí)間高濃度吸氧可導致肺損傷,從而導致BPD的發(fā)生[7].活性氧簇(ROS)增多所致的氧化應激損傷是早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)生的主要機制[8],而SIRT1蛋白能顯著(zhù)降低ROS水平和促進(jìn)細胞生存[9].

  SIRT1蛋白是一種NAD+依賴(lài)性脫乙酰酶,作為哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)蛋白,其主要功能是調節細胞氧化應激反應和調控生命周期。SIRT1蛋白主要定位于細胞核,在細胞能量代謝、DNA損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抗氧化逆境和延長(cháng)細胞壽命方面發(fā)揮重要的調控作用,是機體內抗氧化應激的關(guān)鍵蛋白[10,11].Yang等[12]用紫外線(xiàn)輻射、過(guò)氧化氫誘導人肺腺癌細胞后發(fā)現,SIRT1蛋白可發(fā)生翻譯后修飾,在734位賴(lài)氨酸上發(fā)生小泛素樣修飾蛋白(SUMO)修飾。該修飾決定著(zhù)SIRT1蛋白在細胞核的定位。這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、可逆的過(guò)程,其去SUMO修飾的過(guò)程則由SENP1介導[13,14].SIRT1蛋白主要存在于細胞核,少量存在于細胞質(zhì),當細胞應激時(shí)SIRT1蛋白能被SENP1去SUMO化,使p53蛋白的第382位賴(lài)氨酸殘基去乙;瘻p少,抑制p53與靶DNA順式原件結合,進(jìn)而抑制p53促凋亡活性[15~18].本研究顯示,高氧組細胞生長(cháng)較差,細胞間隙增寬,懸浮細胞較多,細胞的凋亡率增加,這與我們的前期實(shí)驗[6]結果一致,即高氧可以誘導細胞凋亡。本研究還顯示,高氧組SENP1蛋白表達、SIRT1轉位率、乙;痯53表達均較對照組升高,這與Yang等[12]結果一致。提示高氧可誘導細胞凋亡,其凋亡的機制與SIRT1蛋白相關(guān)。

  總之,高氧誘導SENP1蛋白表達,促使SIRT1蛋白發(fā)生去SUMO化,發(fā)生核質(zhì)轉位,去乙;钚詼p低,對p53去乙;钚詼p低,乙;痯53相對增加,從而激活下游的凋亡通路而介導細胞凋亡。

  參考文獻:

  [1]HilgendorffA,ReissI,EhrhardtH,etal.Chroniclungdiseaseinthepreterminfant.Lessonslearnedfromanimalmodels[J].AmJRespirCellMolBiol,2014,50(2):233-245.

  [2]JinL,YangH,FuJ,etal.AssociationbetweenoxidativeDNAdamageandtheexpressionof8-oxoguanineDNAglycosylase1inlungepithelialcellsofneonatalratsexposedtohyperoxia[J].MolMedRep,2015,11(6):4079-4086.

  [3]SchumackerPT.Lungcellhypoxia:roleofmitochondrialreactiveoxygenspeciessignalingintriggeringres-ponses[J].ProcAmThoracSoc,2011,8(6):477-484.

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