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多腫瘤抑制基因p16與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系
【關(guān)鍵詞】 多腫瘤癌癥是人類(lèi)面臨的最大難題，隨著(zhù)分子生物學(xué)和基因工程的進(jìn)展，使我們認識到腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵是正常細胞內基因組發(fā)生了改變，基因改變是導致腫瘤的根本原因［1］。近期的研究結果顯示從腫瘤的誘發(fā)到進(jìn)展是一個(gè)多階段、多因素的復雜過(guò)程，這個(gè)復雜過(guò)程包括腫瘤基因的激活和腫瘤抑制基因的失活，腫瘤基因和腫瘤抑制基因分別以正性和負性調節細胞的生長(cháng)，并參與腫瘤的形成［2］。到目前為止，人類(lèi)已發(fā)現100多個(gè)癌基因和10多種抑癌基因。80年代中期抑癌基因被發(fā)現以來(lái)，其重要作用得到廣泛認可，抑癌基因(tumor supress gene)是正常細胞在調控細胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因組結構穩定、促進(jìn)細胞生長(cháng)、誘導細胞凋亡等方面均有重要意義，它的缺失或失活可引起細胞內癌基因(oncogene)的活化，造成細胞的過(guò)度增生、分化，導致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。癌基因和抑癌基因共同參與調節細胞周期活動(dòng)的分子過(guò)程已為現今癌癥研究的重要課題之一。研究腫瘤發(fā)病的分子生物學(xué)機制，了解各種腫瘤細胞增殖周期中調控因子的狀況，對于進(jìn)行基因診斷、基因治療無(wú)疑具有重大意義。
1 p16(MTS1)基因的發(fā)現和基本結構
1992年美國Skolnick等在黑色素瘤患者中發(fā)現有與細胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)相結合的蛋白，但這種蛋白的基因未被克隆出，隨后對100個(gè)黑色素瘤細胞系采用染色體步移法和序列標記位點(diǎn)圖進(jìn)行分析，發(fā)現1/2的腫瘤細胞在染色體9p21區發(fā)生頻繁的基因突變，推測該區域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在許多人類(lèi)腫瘤集及體外細胞系中均發(fā)現9p21區的缺失和突變。1993年，美國長(cháng)島冷泉實(shí)驗室研究的細胞先驅Serano等利用酵母雙雜和蛋白相關(guān)性篩選法(yeast two-hybrid protein interaction screen)發(fā)現并分離了特異性的細胞周期素依賴(lài)性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，證明p16與CDK4結合后cyclinD/CDK4復合物的催化作用明顯降低，并克隆了p16的cDNA。1994年美國鹽湖城Kamb等［3］和圣地亞哥的Nobori［4］分別報道發(fā)現一個(gè)新的抑癌基因：p16，兩個(gè)研究小組發(fā)表了一項重要的研究成果發(fā)現一個(gè)新的抑癌基因：p16蛋白，證明p16與CDK4結合后cyclinD/CDK4復合物的催化作用明顯降低，并克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在對黑色素瘤染色體9p21易感區應用物理圖(physical map)和序列標記位點(diǎn)圖(sequence tagged stites,STSs)分析了100個(gè)黑色素瘤細胞系的純合缺失，發(fā)現在兩個(gè)區域與Serrano報道的p16序列相近，命名為多發(fā)性腫瘤抑制因子1(multiple tumor suppress 1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2與p16序列有93%相同，現命名為p15(kamb A.S
cience,94,264,436-440)。p16基因位于人類(lèi)的9號染色體短臂(9p21)上，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內含子組成，外顯子1包括E1α和E1β，E1α，126bp；E1β，180bp；外顯子2 307bp；外顯子3 11bp。全長(cháng)8.5kb，氨基酸序列分析表明成熟的p16分子量為15.84kD的單鏈多肽，含有一個(gè)由148個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框架，具有一個(gè)有4個(gè)ankyrin序列組成(回鉤狀重疊的空間構型的蛋白結構)，這一構型為維持其活性所必需，參與蛋白與蛋白之間的作用［4］。
2 作用機制
細胞增殖分裂是細胞最基本的生理活動(dòng)，越來(lái)越多的研究證明，細胞分裂周期的精確性及定時(shí)性是正常細胞生長(cháng)和分化所必需的，細胞作為機體的最小單位，其生長(cháng)過(guò)程總是處于一種增殖的動(dòng)態(tài)平衡之中，這才能保證機體正常的生長(cháng)、發(fā)育。這就意味著(zhù)細胞內必然存在著(zhù)促進(jìn)和抑制增殖兩種體系［5］，包含于這一過(guò)程中的蛋白質(zhì)及基因的改變與腫瘤發(fā)生及其惡性表形密切相關(guān)。典型的一個(gè)細胞周期包括有嚴格順序的4個(gè)期即G1SG2M，它是由MPF(maturation promoting factor,MPF)所推動(dòng)。并受到信號轉導途徑和反饋環(huán)路的精密調控。MPF含兩種蛋白質(zhì)組分，其一為cdc2蛋白(cell division cycle 2 protein)，另一為細胞周期蛋白(cyclin)，在整個(gè)細胞周期中cdc2蛋白的濃度是穩定的，它的活動(dòng)受到細胞周期蛋白的調節，細胞是否進(jìn)入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取決于其能否順利通過(guò)若干關(guān)卡(check points)，其中最重要的是G1/S轉換和G2/M轉換。前者又稱(chēng)為“啟動(dòng)點(diǎn)(start)”或“限制點(diǎn)(restriction point)”，位于G1期末，DNA合成的起始，后者位于M期的初始�，F已證明，激活的CDK在這兩個(gè)轉換過(guò)程中起關(guān)鍵作用［6］。在高等的真核細胞，細胞周期蛋白分為A、B、C、D、E五種，它們分別在細胞周期的不同時(shí)期積累，激活相關(guān)細胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期細胞周期蛋白是指在G1或G1/S交界處發(fā)揮作用啟動(dòng)細胞周期并促進(jìn)DNA合成的周期蛋白，有C、D、E等多種，其中cyclinD1能激活CDK4、6調節G1/S轉換，促進(jìn)細胞分裂周期由G1期進(jìn)入到S期，進(jìn)行DNA合成［7］，cyclinD實(shí)際上可以視為一種癌基因，其過(guò)度表達會(huì )導致細胞增殖失控。最重要的研究發(fā)現是CDK抑制因子與腫瘤生長(cháng)密切相關(guān)，對于CDK抑制因子p21的研究首先證明了這一點(diǎn)，p21是作為含有PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在內的CyclinD-CDK四聚體復合物中的一員在正常人纖維母細胞中首先被發(fā)現的［7］。對p16的研究進(jìn)一步闡明了CDK抑制因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。這就構成了cyclins(細胞周期素)-CDKs(細胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶，cyclins dependent kinases)-CKIs(細胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶的抑制蛋白，cyclins dependent kinases inhibitors)這一以CDKs為中心的細胞周期網(wǎng)絡(luò )調控系統。p16通過(guò)與cyclinD競爭結合CDK4、CDK6抑制cyclinD/CDK4的活性，參與并調節細胞從G0期進(jìn)入G1期，去除p16的抑制作用，將使細胞異常增殖，過(guò)度周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活，都會(huì )導致CDKs的過(guò)度作用，導致細胞非正常增生。野生型抑癌基因Rb的蛋白產(chǎn)物PRb的活性是通過(guò)磷酸化作用獲得的，CDK4、CDK6作為PRb的激酶與此密切相關(guān)，Liu等［8］提出PRb發(fā)生磷酸化后，導致與PRb結合的TF(Transcription Factor)的釋放，如E2F，E2F是通過(guò)激活與細胞增殖有關(guān)的基因，如DNA合成酶-α，從而調控細胞周期由G1期到S期，E2F與未磷酸化的PRb結合時(shí)沒(méi)有轉錄活性，但與磷酸化的PRb分離后將激活p16基因轉錄，隨著(zhù)p16 mRNA水平的增多，和CDK4、CDK6結合的p16也增多，致使cyclinD/CDK4、
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