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淺談硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的釋放度和藥效學(xué)研究
【摘要】 目的 考察硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的體外釋放度及其藥效。方法 采用pH梯度法制備硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體，用透析法測定其體外釋放度和血漿釋放度，通過(guò)抗小鼠S180腫瘤的抑瘤率評價(jià)藥效。結果 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度符合零級動(dòng)力學(xué)模型;聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯修飾的硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體釋放度降低，抑瘤率顯著(zhù)提高。結論 長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體降低藥物釋放度，提高藥效。
【關(guān)鍵詞】 硫酸長(cháng)春新堿 脂質(zhì)體 長(cháng)循環(huán)脂質(zhì)體 釋放度 藥效學(xué)
Abstract:Objective To investigate the release rate and pharmacodynamics in vitro of of vincristine sulfate liposomes. Methods Vincristine sulfate liposomes was prepared by pH gradient method. The release rate was measured by dialysis method. Pharmacodynamics of vincristine sulfate liposomes was evaluated by its antitumor efficacy. Results The release rate of vincristine sulfate liposomes in vitro was fitted to zero?order model. After modification with long?circulating adjuvant, the release rate of vincristine sulfate liposomes decreased and antitumor efficacy increased obviously. Conclusion Long?circulating vincristine sulfate liposomes decrease release rate and increase curative effect.
Key words:vincristine sulfate; liposome; long?circulating liposome; release rate; pharmacodynamics
硫酸長(cháng)春新堿(vincristine, VCR)為長(cháng)春花生物堿類(lèi)抗腫瘤藥物，對白血?⒘馨土鼉哂邢災?钚浴A俅燦τ玫牧蛩岢ご盒錄釵?⑸浼粒?嬖謐乓┪鋨胨テ詼獺⒋?豢�、神�?低澈臀賦Φ藍拘鄖康熱鋇恪S醒芯勘礱鰨??侍遄魑?怪琢鲆┪鐫靨蹇梢愿納埔┪錮砘?災�、提高疗效、綑n拖低澈吞囟ú課唬ㄈ縲腦�、捎z┑畝靖弊饔茫?]。Peter MK等人的研究也表明，硫酸長(cháng)春新堿制成脂質(zhì)體能改善藥物體內行為、提高療效、降低毒副作用[2]。因此，抗腫瘤藥物與脂質(zhì)體結合的處方設計越來(lái)越受到關(guān)注。
本文采用主動(dòng)載藥法中的pH梯度法，以氫化大豆卵磷脂/膽固醇(HSPC/Chol)為脂質(zhì)體膜制備硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體�？疾炝蛩衢L(cháng)春新堿脂質(zhì)體的釋放度和抗小鼠S180腫瘤抑瘤率，同時(shí)考察長(cháng)循環(huán)輔料聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯(CHSPEG2000)對釋放度和抑瘤率的影響，以期為該藥臨床應用提供更好的給藥劑型。
1 實(shí)驗材料
1.1 試藥
硫酸長(cháng)春新堿(廣州環(huán)葉制藥有限公司)，硫酸長(cháng)春新堿對照品(中國藥品生物制品鑒定所)，氫化大豆卵磷脂(HSPC，德國)，膽固醇(Chol，藥用，溫州市甌海食品生化廠(chǎng))，CHSPEG2000 (聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯，自制)，陽(yáng)離子樹(shù)脂(上海樹(shù)脂廠(chǎng))，其他試劑均為分析純。
1.2 儀器
P230高效液相色譜儀(大連依利特)，FC204分析天平(上海精科儀器廠(chǎng))，電熱恒溫水浴鍋(大連醫療器械廠(chǎng))，PHS?25型pH計(上海精科雷磁)，DF?101磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng))，透析袋(美國VIKASE公司)，M?110L型微射流儀(美國microfluids公司)。
1.3 動(dòng)物
小白鼠(18～22 g，沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心，SCXK 遼2005-008);家兔(2～3 kg，沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心，SCXK 遼2005—008);S180腫瘤(遼寧省腫瘤研究所)。
2 方法與結果
2.1 pH梯度法制備硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體及包封率測定[3]
2.1.1 HPLC條件
色譜柱：Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相：甲醇?水?二乙胺(體積比70∶30∶0.5)(磷酸調pH7.0);柱溫：35 ℃;流速：1.2 mL/min;紫外檢測波長(cháng)：298 nm。
2.1.2 空白脂質(zhì)體的制備
將HSPC、Chol按2∶1(質(zhì)量比)混合，加適量無(wú)水乙醇，65 ℃水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加枸櫞酸緩沖液(0.3 mol/L，pH 4.30)，65 ℃水化30 min，用微射流儀循環(huán)數次，依次通過(guò)0.8和0.45 μm的微孔濾膜整粒，得空白脂質(zhì)體。將HSPC、Chol、CHSPEG2000按2∶1∶0.2(質(zhì)量比)混合，其他操作同上，得長(cháng)循環(huán)空白脂質(zhì)體。
2.1.3 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的制備
取空白脂質(zhì)體0.2 mL、硫酸長(cháng)春新堿溶液(1.0 g/L)1.0 mL和Na2HPO4溶液(0.375 mol/L;pH 9.0)0.8 mL混勻(pH 7.3)，于60 ℃孵化10 min，得硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體。取長(cháng)循環(huán)空白脂質(zhì)體同法操作，得長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體。
1.4 硫酸長(cháng)春新堿標準曲線(xiàn)制備
取硫酸長(cháng)春新堿對照品儲備液(0.1 g/L)，用70%(體積分數)甲醇配制成1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mg/L的系列溶液，濾過(guò)，HPLC測定;以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(ρ)線(xiàn)性回歸，得回歸方程A=14.5ρ+3.1(r=0.999 9)，線(xiàn)性范圍1.0～12.5 mg/L。
2.1.5 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體藥物回收率測定
取0.8，1.0，1.2 g/L的硫酸長(cháng)春新堿溶液各1 mL，分別加入空白脂質(zhì)體0.2 mL和Na2HPO4溶液0.8 mL，制備不同濃度硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體。取各濃度脂質(zhì)體各0.3 mL分別置于5 mL量瓶中，以去離子水定容，搖勻，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，HPLC法測定。代入標準曲線(xiàn)計算藥物含量，進(jìn)而計算回收率。結果表明，硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體中藥物回收率為 98.1%～101.8%。
2.1.6 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體包封率的測定
1.2”中硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體0.3 mL兩份，一份置5 mL量瓶中，以去離子水定容，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過(guò);另一份上陽(yáng)離子樹(shù)脂柱，以去離子水洗脫，收集5 mL洗脫液，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過(guò)。HPLC測定，計算包封率：包封率=A過(guò)柱/A未過(guò)柱，其中A過(guò)柱表示脂質(zhì)體包封的硫酸長(cháng)春新堿的色譜峰面積;A未過(guò)柱表示總的硫酸長(cháng)春新堿的色譜峰面積。
結果表明，硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的包封率為86.9%，長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體包封率提高到92.8%。
2.2 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度的考察
2.2.1 分析方法建立
將4 mL空白脂質(zhì)體裝入預處理好的透析袋中，于37 ℃生理鹽水(100 mL)中透析10 h，取外層透析液用紫外分光光度計于298 nm測定吸光度(λVCR 297.8 nm)，吸收值為零。說(shuō)明空白脂質(zhì)體在10 h內未通過(guò)透析袋，可采用透析法測定硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的體外釋放度。
2.2.2 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度的測定
取硫酸長(cháng)春新堿溶液、硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體和長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體各4 mL，分別加入預處理好的透析袋中，再分別置于37 ℃生理鹽水中透析，定時(shí)取透析液2 mL，并補加等量生理鹽水。將透析液濾過(guò)，測定藥物濃度，計算通過(guò)半透膜的藥物累積釋放量Mt，進(jìn)而計算累積釋放度，結果見(jiàn)圖1。
Mt=cnV0+∑ni=1ci-1V
其中，V0為釋放介質(zhì)體積,cn為第n次取樣時(shí)濃度,V為取樣體積。
圖1 硫酸長(cháng)春新堿溶液和脂質(zhì)體累計釋放度 Fig.1 Fractional release of vincristine sulfate liposomes
with different compositions
將硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體和長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體中藥物累積釋放度(F)對時(shí)間(t)線(xiàn)性擬合，方程分別為F=3.1t+0.9 (r=0.998 5)和F=0.8t+0.7 (r=0.998 0)，表明兩種脂質(zhì)體均符合零級釋藥模型。由方程斜率可知，CHSPEG2000修飾可降低脂質(zhì)體中藥物釋放速率，10 h硫酸長(cháng)春新堿的釋放度由32.43%降低到8.6%。
2.3 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體血漿釋放度的考察
2.3.1 硫酸長(cháng)春新堿水溶液標準曲線(xiàn)制備
取硫酸長(cháng)春新堿對照品儲備液(1.0 g/L)，用去離子水配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中,分別以甲醇定容。HPLC法測定，以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，方程為A=19.0ρ+2.7(r=0.999 6)，線(xiàn)性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.2 硫酸長(cháng)春新堿血漿溶液標準曲線(xiàn)制備
取硫酸長(cháng)春新堿對照品儲備液(1.0 g/L)用血漿配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中甲醇定容，混勻，15 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)濾進(jìn)樣，得回歸方程A=18.3ρ+2.3(r=0.998 9)，線(xiàn)性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.3 血漿中硫酸長(cháng)春新堿回收率的測定
配制5.0，10.0，15.0 mg/L的硫酸長(cháng)春新堿血漿溶液，按“2.3.2”方法操作，HPLC測定A，代入水溶液標準曲線(xiàn)，求算藥物濃度，并計算回收率。結果表明，血漿中藥物回收率為97.9%～102.1% 。
2.3.4 陽(yáng)離子樹(shù)脂對血漿中硫酸長(cháng)春新堿的吸附
配制系列濃度的硫酸長(cháng)春新堿血漿溶液(40～120 mg/L)，37 ℃水浴孵化10 min，各取1 mL溶液，分別上陽(yáng)離子樹(shù)脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，HPLC法測定。結果表明，過(guò)陽(yáng)離子樹(shù)脂的溶液未檢測出硫酸長(cháng)春新堿，說(shuō)明陽(yáng)離子交換樹(shù)脂能完全吸附血漿中游離和蛋白結合的硫酸長(cháng)春新堿，此法可以檢測脂質(zhì)體的血漿釋放度。
2.3.5 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體血漿釋放度的測定
取硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體和長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體各4 mL(CVCR 0.5 g/L)，分別與20 mL血漿混勻，37 ℃定時(shí)取樣1 mL，上陽(yáng)離子樹(shù)脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容。HPLC法測定，計算釋放度，結果見(jiàn)圖2。結果表明，硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體和長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體在血漿中24 h分別釋放61.5%和51.4%。
2.4 硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體的藥效學(xué)研究
將復蘇的S180細胞接種于小鼠腹腔內，約5 天抽出腹水用生理鹽水稀釋后傳代。將接種S180腫瘤的小鼠隨機分為4組：模型組、硫酸長(cháng)春新堿溶液組、硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體組、長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體組，每組10 只，右側腋下接種(0.2 mL/只)，第3、6、9、12 天尾靜脈注射給藥，第15 天將小鼠拉斷頸椎處死，剝離瘤體稱(chēng)重。結果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著(zhù)性(P0.01);長(cháng)循環(huán)脂質(zhì)體組與溶液組比較，差異有顯著(zhù)性(P0.05)，而脂質(zhì)體組與溶液組差異則無(wú)顯著(zhù)性，見(jiàn)表1。表1 各組瘤重結果
3 討 論
3.1 脂質(zhì)體血漿釋放度作為體外檢測手段可以為體內釋放度的預測提供依據。本文采用陽(yáng)離子樹(shù)脂分離血漿中的脂質(zhì)體和硫酸長(cháng)春新堿，用HPLC法測定脂質(zhì)體包封的藥物含量，進(jìn)而計算硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體釋放度。結果表明，長(cháng)循環(huán)脂質(zhì)體比硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體藥物釋放度低，說(shuō)明長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體體內循環(huán)時(shí)間延長(cháng)，更有利于發(fā)揮藥效。
3.2 藥效學(xué)試驗中，用SPSS10.0統計軟件對各組瘤重進(jìn)行多樣本均數間多重比較。結果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著(zhù)性(P0.01);長(cháng)循環(huán)脂質(zhì)體組與溶液組比較，差異有顯著(zhù)性(P0.05)，而脂質(zhì)體組與溶液組差異則無(wú)顯著(zhù)性。其原因可能是，脂質(zhì)體靜脈給藥后易被網(wǎng)狀內皮系統細胞，特別是單核吞噬細胞作為外來(lái)異物吞噬，且體內成分會(huì )導致脂質(zhì)膜破壞，使藥物滲漏，不能更好發(fā)揮藥效;CHSPEG2000修飾的長(cháng)循環(huán)脂質(zhì)體可以避開(kāi)單核吞噬細胞的吞噬，使更多藥物到達腫瘤部位發(fā)揮療效。因此，長(cháng)循環(huán)硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體可以明顯提高抑瘤率，增強療效。
3.3 CHSPEG2000為本實(shí)驗室合成的一種新型脂質(zhì)體修飾材料。脂質(zhì)體形成過(guò)程中，CHSPEG2000分子的膽固醇端嵌入脂質(zhì)體膜中，PEG端向外伸展形成親水層。在體外PEG層可以防止脂質(zhì)體因融合而造成的藥物滲漏和粒徑增大，并能提高脂質(zhì)體的包封率;在體內PEG層可以防止脂質(zhì)體被巨噬細胞吞噬，有助于更好的發(fā)揮藥效。
【參考文獻】
[1]LAYTON D, TROUET A. A comparison of the therapeutic effect of free and liposomally encapsulated vincristine in leukemia mice[J]. Eur J Cancer,1980,16: 949.
[2]PETER M K, GRAY M K, GRAY M B, et al. Liposome encapsulated vincristine :preclinical toxicologic and pharmacologic comparison with free vincristine and empty Liposomes in mice, rats and dogs[J].Anti Cancer Drug,1994(5): 579.
[3]趙妍，于彬，鄧意輝，等.主動(dòng)載藥法制備硫酸長(cháng)春新堿脂質(zhì)體及其包封率的測定[J].中國藥學(xué)雜志，2005，40(20):1 559.
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