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博士研究生學(xué)位論文開(kāi)題報告
開(kāi)題報告是學(xué)位論文的一個(gè)總體規劃和設計，是研究生學(xué)位論文工作的重要環(huán)節，以下是小編搜集整理的博士研究生學(xué)位論文開(kāi)題報告，歡迎閱讀參考。論文題目：TGF-β1對白血病細胞的作用研究及其機制初探
一、立題依據
轉化生長(cháng)因子β(transforming growth factor-β，TGF- β)是一種多功能細胞因子，因其能使正常成纖維細胞的表型發(fā)生轉化而得名。它有五種異構體：TGF-β1 TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4、 TGF-β5，其中TGF-β1作用最強，目前的研究也主要針對TGF-β1。TGF-β1是迄今為止了解的功能最復雜的細胞因子之一，是一種具有多種生物學(xué)功能的生長(cháng)因子,目前已知的功能主要有調節細胞生長(cháng)和分化，誘導細胞凋亡,影響細胞粘連和細胞遷移，促進(jìn)細胞外基質(zhì)的形成,調節胚胎發(fā)育過(guò)程,促進(jìn)創(chuàng )傷愈合，參與對免疫抑制以及炎癥反應的調節等，TGF-β1還是促進(jìn)肝臟纖維化的重要細胞因子。TGF-β1 對不同的靶細胞也表現出不同的生物學(xué)活性，TGF -β受體廣泛表達于機體組織細胞,由于體內大部分的正常細胞均表達TGF -β家族成員的膜結合受體, TGF-β1與其受體具有高度特異的親和力,因此, TGF-β1對許多細胞都發(fā)揮調節作用;生長(cháng)抑制是TGF-β1特有的性質(zhì), TGF-β1對大多數細胞的增值具有抑制作用,尤其是上皮細胞、內皮細胞、淋巴樣細胞或造血細胞。
TGF-β1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在腫瘤發(fā)生早期, TGF-β1 作為腫瘤抑制因子起作用, TGF-β1對正常細胞及早期腫瘤的抑制作用是通過(guò)調控細胞周期,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡來(lái)實(shí)現的，通過(guò)抑制細胞生長(cháng)周期從G1 →S 期抑制正常細胞生長(cháng)和腫瘤細胞發(fā)生。在G1 期早期, TGF-β1誘導的抑制信號作用于原癌基因c-myc ,抑制腫瘤的形成; 在G1期晚期, TGF-β1通過(guò)抑制細胞周期蛋白(cyclins) , 通過(guò)增加周期循環(huán)蛋白依賴(lài)性激酶(CDKs)的抑制性蛋白p15 、p21 、p27 的生成,抑制CDKs的活性,使細胞停止在G1 期或延長(cháng)G1 期,進(jìn)而抑制細胞增殖, 誘導細胞分化或凋亡 。如果TGF-β1信號通路中多種基因突變導致細胞對TGF-β1耐受而使衰老和凋亡通路失活,則可能發(fā)生細胞癌變。c-myc蛋白是細胞增殖的重要的調節因子,表達c-myc的細胞能迅速通過(guò)G1 期進(jìn)入S 期,而 TGF-β1可迅速下調c-myc 的mRNA 及蛋白水平。 近年來(lái),圍繞TGF-β1誘導凋亡的分子機制進(jìn)行了大量的基礎研究。研究表明:在許多類(lèi)型細胞中, TGF-β1家族成員不僅能抑制細胞增殖且誘導細胞凋亡,由Smad 轉錄復合物控制的前凋亡基因在TGF-β1誘導細胞凋亡的過(guò)程中起重要作用。 在造血細胞中, TGF-β1誘導的凋亡依賴(lài)于依賴(lài)Smad 的SHIP 表達的上調并通過(guò)生存蛋白激酶AKT抑制信號系統。
TGF-β1作為一種重要的腫瘤抑制因子,在血液系統疾病的發(fā)生中起重要作用，我們已在這方面開(kāi)展了若干研究中。我們前期研究中曾用ELISA法檢測急性白血病患者血清及急性白血病原代細胞和細胞株培養上清TGF-β1 水平變化，研究發(fā)現急性白血病患者血清中TGF-β1水平明顯減低，經(jīng)治療獲緩解后其水平恢復正常，復發(fā)患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代細胞和細胞株培養上清TGF-β1水平與正常細胞相比有明顯下降。應用 RT-PCR 方法檢測正常巨核細胞、血小板、外周血有核細胞及8種細胞株包括有HEL、K562 、HL60 、U937 、DAMI、MEG-01 、HUT78、CA的TGF-β1 mRNA，結果顯示這些細胞均能表達TGF-β1，這說(shuō)明在白血病患者血清及急性白血病原代細胞和細胞株培養上清中TGF-β1的低水平很可能與TGF-β1自身產(chǎn)生過(guò)程下游蛋白的生成、包裝、分泌受破壞有關(guān)，這也提示TGF-β1的低表達可能在急性白血病發(fā)病機制中起重要作用。
TGF-β1對紅系、粒系、巨核系晚期祖細胞的分化均具有刺激作用，TGF-β1還有誘導粒系、淋巴系白血病細胞的凋亡作用，我們的研究發(fā)現全反式維甲酸誘導HL-60細胞分化成熟的過(guò)程中，內源性TGF-β1 mRNA表達上調，我們的研究也發(fā)現加入外源性豬全長(cháng)TGF-β1基因可抑制白血病細胞增殖，誘導白血病細胞凋亡;另一實(shí)驗中，將DAMI細胞與TGF-β1孵育48小時(shí)后不僅其生長(cháng)增殖受抑且有呈現細胞凋亡;而在用 AS2O3誘導 HL-60 細胞凋亡的過(guò)程中TGF-β1 表達水平增高，bcl-2 基因表達減弱，在此過(guò)程中，細胞分泌TGF-β1水平有明顯增高，加入TGF-β1反義ODNS 能夠部分抑制 AS2O3誘導的細胞凋亡，bcl-2 基因表達有所恢復，提示在A(yíng)S2O3誘導的 HL-60細胞凋亡過(guò)程中內源性 TGF-β1 起著(zhù)重要作用，可能是促進(jìn)血細胞凋亡的內在動(dòng)力之一。 同時(shí)我們還利用真核表達載體將外源性野生型p53基因(wt-p53)導入無(wú)p53蛋白表達的 HL-60、K562 細胞中，在 wt-p53 基因誘導 HL-60、K562 細胞凋亡早期內源性 TGF-β1mRNA 表達上調，且細胞分泌 TGF-β1 的水平有明顯提高，TGFβ1 的反義 ODNS 能夠部分抑制 wt-p53 誘導的細胞凋亡,使 wt-p53 所致的 K562 細胞 bcl-2 表達陽(yáng)性率恢復到未經(jīng) wt-p53 處理前的水平，提示 wt-p53 基因在誘導白血病凋亡過(guò)程中內源性TGF-β1發(fā)揮一定作用，內源性 TGF-β1與 bcl-2 表達之間存在密切關(guān)系。
由于TGF-β1有如此復雜的功能，對不同的靶細胞也表現出不同的生物學(xué)活性，我們設想通過(guò)外源誘導物準確定量調控TGF-β1表達，若能調控成功必將能為我們下一步研究TGF-β1與腫瘤關(guān)系提供更多幫助。
迄今為止，己發(fā)展多種可誘導基因表達系統，但各自都有局限性，多數可誘導基因表達以重金屬離子和激素作為誘導劑，誘導表達水平難以準確調控，誘導刺激可引發(fā)多種效應，且在誘導劑存在時(shí)，時(shí)常出現表達滲漏的現象，這些不足限制這些可誘導基因表達系統的應用;而基于LiAC阻遏因子的IPTG誘導表達系統中，盡管其作用較為特異，但誘導過(guò)程緩慢，誘導效率低，且誘導劑量接近細胞毒水平，目前應用最為廣泛的是四環(huán)素調控基因表達系統(Tetracycline-regulated gene expressionsystem)，是由Gossen等人首先建立的。Tet 調控系統主要包括兩部分: 特異啟動(dòng)子控制下的Tc 依賴(lài)的反式作用子(tTA ) 及tTA 依賴(lài)的核心微小啟動(dòng)子(人巨細胞病毒啟動(dòng)子PhCMV) 調控下的目的基因，前者是由大腸桿菌的tetR 和人類(lèi)單純皰疹病毒(HSV ) 的病毒蛋白P16 (V P16) 的C2末端具有轉錄激活作用的區域構成的融合蛋白, 其中TetR 介導tTA 與TetO 的結合,V P16 則具有轉錄激活作用; 后者是在PhCMV 的上游插入7 個(gè)頭尾相連的TetO 序列, PhCMV 本身啟動(dòng)轉錄的能力很低, 但tTA 與TetO 結合后即可激活目的基因高水平地表達, 而Tc可抑制tTA 與TetO 的結合, 從而抑制轉錄，由于Tc的應用阻抑了目的基因的表達, 故將該系統稱(chēng)為T(mén)et-off 系統。
1995年，Gossen等基于Tet-off系統，通過(guò)隨機突變改變四環(huán)素阻遏蛋白(TetR )上4個(gè)氨基酸，使其分子結構發(fā)生變化，建立了Tet-on基因誘導表達系統，該系統受四環(huán)素及其衍生物強力霉素作用剛好與Tet-of系統相反，即在沒(méi)有四環(huán)素及其衍生物強力霉素的情況下，表達水平幾乎為零，而在加入四環(huán)素及其衍生物強力霉素后目的基因高效表達。在Tet-off系統里，如果需關(guān)閉外源基因的表達，就需一直維持誘導物的存在，而Tet - on系統為激活型表達系統，需要外源基因表達時(shí)才加誘導物，相比之下，Tet一on系統具有快速激活基因，誘導動(dòng)力學(xué)受體內Tet的影響相對較小，能更精確的進(jìn)行目的基因的調控，使用更為方便經(jīng)濟。所以，Tet - on系統已被成功的應用于哺乳動(dòng)物細胞培養、轉基因鼠、基因治療研究
T-REx系統是一種用于哺乳動(dòng)物的四環(huán)素調控基因表達系統，其調控元件來(lái)自大腸桿菌E. coli Tn10編碼的四環(huán)素耐藥操縱子。在該系統中，四環(huán)素對目標基因的調控有賴(lài)于外源性四環(huán)素與質(zhì)粒中TetR結合，從而使控制目的基因表達的啟動(dòng)子去阻遏，T-REx系統中最重要的構成成分是可誘導表達質(zhì)粒---pcDNA4/TO/myc-h i s A, B, C。目的基因在該質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子的調控下得以表達。該質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子中含有兩個(gè)四環(huán)素操縱子序列( Tet0 )，每個(gè)四環(huán)素操縱子含有19個(gè)核苷酸(5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')序列。兩個(gè)四環(huán)素操縱子序列被2個(gè)鹼基對的空間所隔開(kāi)。每個(gè)19個(gè)核苷酸序列做為一個(gè)TetR同源二聚體的結合位點(diǎn)。T-Rex中新近發(fā)展的Tet-off/Tet-on系統是一種高效無(wú)毒、具有嚴密開(kāi)/關(guān)功能的基因誘導表達系統，具有嚴密性、特異性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，該系統是目前比較成熟的真核生物基因誘導表達系統之一。
應用T-REx調控系統對導入外源性TGF-β1基因進(jìn)行白血病細胞內源性TGF-β1定量表達調控，以及定量調控后對白血病細胞生物學(xué)特性影響的研究目前國內外均未見(jiàn)報道，本課題的研究旨在進(jìn)一步深入探討TGF-β1對白血病的作用及機制。
二、研究目的、意義和應用前景
以白血病細胞HL-60為模型，人全長(cháng)TGF-β1基因為對象，研究TGF-β1對白血病細胞體外和體內作用的同時(shí)，利用四環(huán)素調控系統,構建可調控的含人全長(cháng)TGF-β1基因真核表達載體，用脂質(zhì)體轉染法將人TGF-β1基因轉染HL-60細胞中，研究TGF-β1基因轉染后HL-60細胞的TGF-β1表達的定量調控，及轉染基因細胞的生物學(xué)特性改變，觀(guān)察轉染基因細胞的體內致瘤性，進(jìn)一步探討TGF-β1對白血病的作用及機制。
三、課題設計方案及技術(shù)路線(xiàn)
(一)研究TGF-β1對HL-60細胞體內外抗白血病的作用。
(二) pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒構建。
通過(guò)酶切→去磷酸化→連接→轉化→單克隆菌落培養擴增→大量抽提，構建并提取構建好的pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、酶切電泳鑒定、及最終DNA測序，選出全長(cháng)TGF-β1片段正向連入pcDNA4/TO的質(zhì)粒。
(三) pcDAN6/TR質(zhì)粒轉染HL-60細胞并篩選，單克隆擴大培養。
1、確定Blasticidin 的篩選濃度。
2、脂質(zhì)體法轉染HL-60細胞，通過(guò)Blasticidin篩選，獲得穩定轉染細胞命名TREx- HL-60細胞。
(四)將構建的pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒轉染 TREx- HL-60細胞,并篩選，單克隆擴大培養。
1、確定Zeocin的篩選濃度。
2、脂質(zhì)體法轉染 TREx- HL-60細胞,通過(guò)Zeocin篩選，獲得穩定轉染細胞命名HL-60-PTT細胞。
(五) 對HL-60-PTT細胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。
1、用ELISA法 、 Western blot方法測定不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細胞的TGF-β1 的表達水平。
2、用定量PCR法測定不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細胞的TGF-β1 mRNA.、TGF-β2 mRNA、TGF-β3 mRNA及TGF –βRⅠ、TGF –βRⅡ、hTERT、 Smad3、4、7、c-myc、bcl-2等基因表達的水平的變化。
3、觀(guān)察不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細胞的增殖情況(分別采用MTT法測定、白血病細胞集落培養法及流式細胞儀檢測法)
4、對HL-60-PTT細胞進(jìn)行細胞調亡檢測(分別采用片段化DNA分析、TUNNEL及流式細胞儀測定DNA含量方等法檢測。)
5、觀(guān)察ATRA誘導HL-60-PTT細胞分化過(guò)程中,不同濃度四環(huán)素作用下以下指標的變化。
a、細胞分化的檢測：瑞氏染色觀(guān)察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測分化抗原。
b、RT-PCR法檢測不同劑量下ATRA對HL-60-PTT細胞的影響：對TGF-β1 的定量表達與端粒酶活性及hTERT、c-myc和bcl-2等表達影響的研究。
(六) 通過(guò)攝入不同濃度四環(huán)素進(jìn)一步研究轉染后HL-60-PTT細胞對裸鼠荷瘤的影響。
觀(guān)察腫瘤生長(cháng)大小、腫瘤細胞調亡情況及對小鼠心、肺、肝、脾、腎等臟器的影響。
四、預實(shí)驗結果
成功構建pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒，已篩選并擴大培養TREx- HL-60細胞,目前正進(jìn)一步單克隆轉染細胞HL-60-PTT，通過(guò)ELISA法檢測瞬時(shí)轉染細胞上清TGF-β1，證實(shí)不同濃度四環(huán)素能誘導出不同水平的TGF-β1。(詳見(jiàn)幻燈)
五、統計學(xué)方法
結果以數據及圖表表示，測定值以均數±標準差表示，采用SPSS11.0軟件分析，多組間均數比較用單因素方差分析，組間比較用最小顯著(zhù)差法。
六、課題進(jìn)展安排
20XX.1-20XX.6 查閱文獻、確定課題
20XX.7-20XX.6 實(shí)驗前準備、預實(shí)驗
20XX.7-20XX.3 正式實(shí)驗
20XX.4-20XX.7 撰寫(xiě)論文、答辯
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