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堿度對硫酸鹽還原效率及微生物群落動(dòng)態(tài)的影響
引言
高濃度有機廢水的處理多采用厭氧技術(shù)，但是當廢水中含有高濃度硫酸鹽時(shí)，會(huì )給廢水處理帶來(lái)很大困難，即由于硫酸鹽還原過(guò)程的介入，使厭氧降解過(guò)程出現了產(chǎn)甲烷菌(MPB)與硫酸鹽還原菌(SRB)之間對底物的競爭以及硫酸鹽還原產(chǎn)物對MPB 和SRB 毒性抑制等問(wèn)題[1]�；诖�，應用兩相厭氧工藝中的產(chǎn)酸相對硫酸鹽進(jìn)行預去除的策略得到廣泛認同。
碳硫比、硫氮比、硫酸鹽負荷、水力停留時(shí)間和碳源種類(lèi)等環(huán)境因子都能夠影響產(chǎn)酸硫酸鹽還原效率，國內外學(xué)者對這些生態(tài)因子在硫酸鹽還原過(guò)程中的作用也進(jìn)行了較為深入的探討[2,3]。然而，堿度作為直接影響系統pH，從而保持系統穩定性的關(guān)鍵環(huán)境生態(tài)因子，卻很少有研究報道。在硫酸鹽還原過(guò)程中，堿度可以及時(shí)緩沖產(chǎn)酸菌產(chǎn)生的揮發(fā)酸(VFA)，并降低CO2 的產(chǎn)生和溶解對pH 值的影響，維持體系所需pH 值。硫酸鹽還原體系中與酸堿平衡有關(guān)的共軛酸堿對主要有：H2CO3/HCO3-，HCO3-/CO32-，H2S/HS-，HS-/S2-，HAc/Ac-等。隨著(zhù)反應體系pH 值的不同，這些共軛酸堿對在各種形態(tài)間的分布也會(huì )發(fā)生變化[4]。
本研究應用厭氧折流板反應器(ABR)，探討調節進(jìn)水堿度過(guò)程中，硫酸鹽還原效率的變化情況，同時(shí)應用分子生物學(xué)方法解析微生物群落對堿度變化的響應，研究結果可為SRB生態(tài)學(xué)理論提供有益補充，也可為硫酸鹽廢水處理工藝的改進(jìn)和革新提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗設計
試驗采用厭氧折流板反應器，裝置分為五個(gè)格室，總體積24 L，有效容積21 L。模擬廢水成分中COD 為4000 mg/L(乳酸和/或乙酸)，SO42-為2000 mg/L，另加少量(NH4)2HPO4以補充氮磷，pH 7.0~7.5，水力停留時(shí)間(HRT) 24 h，運行溫度35±1℃。根據進(jìn)水堿度不同，試驗分為五個(gè)階段，第一階段為反應器啟動(dòng)階段，不調節進(jìn)水堿度，進(jìn)水堿度約為500 mg/L，歷時(shí)46 d；第二階段進(jìn)水堿度通過(guò)投加NaHCO3 調節至1000 mg/L 左右，歷時(shí)32 d；第三個(gè)階段為從第79 d 至124 d，將進(jìn)水堿度提升到2000 mg/L；第四階段是從第125 d 至135 d，又將堿度降到1000 mg/L；最后一階段是從第136 d 開(kāi)始，將堿度提高至2000 mg/L。反應器運行過(guò)程中，根據文獻[4]的方法，對進(jìn)出水中的VFA、硫酸鹽濃度、堿度和pH 值、硫化物濃度及氧化還原電位(ORP)進(jìn)行檢測。
1.2 微生物群落分析
定期于反應器第3 格室中部吸取活性污泥，采用土壤DNA 提取試劑盒(Mobio，USA)提取微生物總DNA 。PCR 擴增采用細菌16S rRNA 基因通用引物BA341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和BA534R (5’-ATTACCGCGGCTGCTGG -3’)， 引物BA534R 5’端帶有40 bp GC 夾，根據文獻[5]對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DGGE 分析。
DGGE 圖譜數字化后，對DGGE 圖譜中各泳道微生物進(jìn)行Shannon-Weiner 多樣性指數(H′)分析，H′通過(guò)公式H′=?ΣPi lnPi 計算，其中Pi 是泳道中條帶的相對信號強度；采用SPSS軟件(SPSS Inc.，Chicago IL)以Ward’s 方法對各泳道群落進(jìn)行聚類(lèi)分析，并與反應器運行狀態(tài)相結合，解析群落變化與反應器功能的關(guān)系。
DGGE 圖中條帶按文獻[5]方法回收并克隆測序。序列通過(guò)RDP中的Seq Match 程序進(jìn)行分類(lèi)，然后以Blast 在線(xiàn)工具檢索最相近序列。
2 結果與討論
2.1 堿度變化對硫酸鹽去除效率的影響
試驗中的堿度主要為NaHCO3 堿度，可緩沖體系pH 值的變化，從而維持體系相對穩定，并為功能微生物提供良好的生存環(huán)境，提高硫酸鹽去除率。從可見(jiàn)，在A(yíng)BR 運行的第一階段，進(jìn)水中未加NaHCO3 調節堿度，進(jìn)水堿度很低的情況下，出水pH 為6.5 左右，但波動(dòng)很大。由文獻[2]可知，當系統內pH 維持在6.0 左右時(shí)，反應體系主要是Ac-(揮發(fā)酸，以Ac-表示)堿度，體系對于酸的緩沖能力減弱，反應器呈現酸化的趨勢。
由可見(jiàn)，反應器在前46 d 內進(jìn)水堿度維持在500 mg/L 左右，體系的去除率在40%，而且波動(dòng)較大。從第47 d 開(kāi)始，加入NaHCO3 進(jìn)行調節進(jìn)水堿度，使其維持在1000 mg/L，其去除率逐漸提高至75%，此時(shí)，出水pH 上升至7.0 以上，且出水堿度也隨之升高至2500mg/L。NaHCO3 為強堿弱酸鹽，當體系中H+增加時(shí)，HCO3-可以與其反應，緩沖pH 變化。
從第78 d 開(kāi)始，將進(jìn)水堿度調整為2000 mg/L，硫酸鹽的去除率提高到90%。文獻表明[6]，在反應器啟動(dòng)初期，當不調節進(jìn)水堿度時(shí)，進(jìn)水在產(chǎn)酸菌的作用下，產(chǎn)生大量酸性末端產(chǎn)物，導致pH 值下降，在低pH 下，硫化物易生成H2S，由于中性的H2S 更容易進(jìn)入細胞體內，故能夠抑制甚至殺死SRB。所以在啟動(dòng)期，SRB 對H2S 的毒性耐受力較差，最終將導致SRB生長(cháng)和繁殖能力降低，硫酸鹽去除率下降。而在高pH 下，體系中主要以HS-形式存在，降低了對SRB 的毒性，從而使硫酸鹽的去除率有所提高。
SRB 獲取能量的主要途徑主要是硫酸鹽異化還原過(guò)程，該過(guò)程須在較低的氧化還原電位下才能進(jìn)行，文獻[6]指出，要維持硫酸鹽去除率在80%以上，ORP 必須低于-320 mV。ORP受系統內pH 值的直接影響，從可以看出，當系統內pH 在6.2~6.8 之間時(shí)，ORP 維持在-320 mV 左右；當投加堿度后，系統出水pH 值逐步上升，系統內ORP 不斷降低，最終維持在-420 mV 左右�？梢�(jiàn)，pH 值與ORP 呈負相關(guān)。
在反應器的啟動(dòng)期，進(jìn)水的堿度大約為500 mg/L，末端產(chǎn)物為乙酸和丙酸。當堿度提高為1000 mg/L 時(shí)，液相末端產(chǎn)物組分中乙酸占據絕對優(yōu)勢，揮發(fā)酸總量上升到3500 mg/L。當堿度繼續提高到2000 mg/L 時(shí)，液相末端產(chǎn)物總量降低，乙酸含量降低至1500 mg/L，但依然占據主導地位。此時(shí)VFA 降低，可能是在反應器后幾個(gè)格室中，逐步形成了產(chǎn)甲烷環(huán)境，產(chǎn)甲烷菌利用了前幾格室產(chǎn)生的VFA，從而使VFA 總量減少�？梢�(jiàn)在低堿度下運行時(shí)，反應器產(chǎn)酸發(fā)酵能力會(huì )逐步降低，而堿度提高能增強反應器產(chǎn)酸功能，并影響著(zhù)發(fā)酵類(lèi)型。
2.2 堿度調節對微生物群落結構的影響
微生物群落的變化對反應器的去除效率有很大影響。分別在反應器運行的不同時(shí)期(第0 d，10 d，18 d，29 d，36 d，43 d，53 d，63 d，77 d，85 d，103 d，111 d，120 d，136 d)獲取泥樣，得到微生物群落DGGE 圖譜及其聚類(lèi)分析(圖未給)。對DGGE 圖譜中的主要條帶進(jìn)行克隆測序分析，結果如所示。
根據DGGE 圖譜及其聚類(lèi)結果，每個(gè)階段內的微生物群落間的相似性較高，而相鄰階段間的微生物群落表現出逐漸過(guò)渡的群落演替趨勢。
在第一次提高進(jìn)水堿度至1000 mg/L 后(53 d)，微生物群落多樣性有所增加，Shannon-Weiner 多樣性指數由2.91 上升至3.16，條帶A8, A9 和A10 得以富集。測序表明它們分別與Desulfomicrobium baculatum, Candidatus ubique 和Desulfomicrobium macestii 相似性較高。Candidatus ubique 在硫酸鹽廢水處理中不常見(jiàn)，這說(shuō)明提高進(jìn)水堿度改變了反應器內原有環(huán)境，使得微生物多樣性得以提高。
對DGGE 圖譜中各群落(泳道)進(jìn)行Shannon- Weiner 多樣性分析可以定量描述不同階段微生物種類(lèi)及數量。多樣性指數(H′)可以評價(jià)一個(gè)微生物群落內物種的豐富性以及微生物數量的多少。由可以看出，反應器運行第一階段，即前50 d，微生物多樣性指數為2.62~2.94，說(shuō)明在該階段微生物的物種比較豐富，反應器運行良好，可以支撐更多種類(lèi)的微生物生存。在反應器運行46 d 以后，DNA 條帶有明顯變化，微生物多樣性指數提高至3 以上，表明微生物多樣性增加，可能是由于進(jìn)水中堿度的增加使原來(lái)未處于優(yōu)勢種群的菌落，得以迅速生長(cháng)繁殖，進(jìn)而提高了生物多樣性。在第三階段，當堿度提高至2000 mg/L 時(shí)，生物多樣性指數變化不大。
2.3 特異類(lèi)群對進(jìn)水堿度變化的響應
由可見(jiàn)，發(fā)現常駐種群條帶(A1, A2, A3 和A4)在反應器的啟動(dòng)和運行過(guò)程中僅數量上有些變化，當堿度劇烈變化時(shí)，這些條帶波動(dòng)幅度較小。測序表明它們分別與Alkaliflexusimshenetskii, Thauera terpenica, Sulfuricurvum kujiense 和Desulfomicrobium norvegicum 等菌株相似性較大。這些菌均為厭氧微生物，存在于各種厭氧環(huán)境中，部分種屬能夠利用廣泛的底物發(fā)酵產(chǎn)酸。根據文獻[7]，在硫酸鹽代謝過(guò)程中，反應器中微生物可分為兩大類(lèi)群，即產(chǎn)酸菌和SRB。產(chǎn)酸菌負責將大分子底物（蔗糖/果糖等）分解為SRB 可利用的底物乙酸，乙醇，氫氣，甲醇，甲酸等，可見(jiàn)這些常駐菌群對硫酸鹽還原過(guò)程具有重要意義，通過(guò)產(chǎn)酸菌和SRB 的種間協(xié)作，形成良好的底物食物鏈關(guān)系，維持微生物代謝的較佳環(huán)境。
第一階段初期生物多樣樣性比較豐富，但隨著(zhù)反應器的運行，生物多樣性指數呈降低趨勢，部分微生物條帶逐漸消亡，如條帶A6 和A7，這可能與革蘭氏陰性菌對堿度較為敏感有關(guān)[6]。而條帶A10 和A13 所指示的種群開(kāi)始富集。
第二階段堿度提高至1000 mg/L 的過(guò)程中，Veillonella sp. S101, Acinetobacter soli,Desulfomicrobium baculatum, Spirochaeta sp. Buddy 得以富集；繼而提高至2000 mg/L 時(shí)，Desulfomicrobium macestii 得以富集， 同時(shí)Veillonella sp. S101, Acinetobacter soli,Desulfomicrobium baculatum 和Spirochaeta sp. Buddy 所指示的條帶濃度繼續加強。
Desulfomicrobium baculatum 和Desulfomicrobium macestii 為不完全氧化型SRB[8]，主要利用乙醇和H2 為電子供體還原硫酸鹽，生長(cháng)環(huán)境酸堿度范圍較寬，最適宜范圍為pH6.0~6.5，是該反應器中硫酸鹽去除率的主要貢獻者。
3 結論
進(jìn)水堿度變化會(huì )明顯影響硫酸鹽的去除率。在沒(méi)有加入NaHCO3 調節堿度的情況下，反應器的去除率為45%左右，當堿度提高至2000 mg/L 后，去除率提高到90%。
低堿度下，反應器內的產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)物降低了系統的pH 值，抑制了某些菌種的生長(cháng)代謝，如Veillonella sp. S101 和Acinetobacter soli。在硫酸鹽還原過(guò)程中，一些常住菌如Alkaliflexus imshenetskii, Thauera terpenica, Sulfuricurvum kujiense 和Desulfomicrobiumnorvegicum 等發(fā)揮重要的作用。
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