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動(dòng)物細胞培養工藝過(guò)程監測與控制
在細胞培養的過(guò)程中，隨著(zhù)細胞的增殖、底物的消耗及產(chǎn)物的生成，整個(gè)培養系統的狀態(tài)一直在產(chǎn)生變化。而各種狀態(tài)變量都有其限制范圍，當超出其界限值時(shí)就會(huì )對培養過(guò)程產(chǎn)生消極的影響，降低培養效率。例如培養基的PH值在培養全過(guò)程都應控制在6.8-7.4的范圍內。因此在動(dòng)物細胞的培養工藝中，利用過(guò)程監測與控制技術(shù)使培養系統保持在最佳的狀態(tài)也是整個(gè)工藝中重要的一環(huán)。過(guò)程監測是指應用各種檢測技術(shù)對培養過(guò)程中狀態(tài)變量的變化進(jìn)行追蹤的行為。當這些變量與預測值或與預期變化方式相偏離時(shí)，通過(guò)過(guò)程監測的手段便可以及早發(fā)現并開(kāi)始利用已設定的模型計算如何改變培養狀態(tài)以及時(shí)補償這種偏離。而過(guò)程控制則利用過(guò)程監測所提供的信息按照暨定方案進(jìn)行調整，以使培養過(guò)程向更好的方向發(fā)展。由于生物培養過(guò)程中許多關(guān)鍵變量的值不能夠直接在線(xiàn)測得，因此過(guò)程監測的基本任務(wù)之一就是利用直接測得的變量值去估算間接變量的值，而這也就是狀態(tài)估計的概念。1、在線(xiàn)測量大規模動(dòng)物細胞培養中由于大量細胞的代謝，細胞培養環(huán)境迅速改變，在線(xiàn)過(guò)程監控更為重要。離線(xiàn)取樣測定特別是產(chǎn)物濃度測定往往需要一天的時(shí)間，因此這種測定結果，不能用來(lái)及時(shí)指導生物反應器有關(guān)參數的控制和細胞培養環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費用。因此在線(xiàn)測定生物反應器中培養條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物濃度等大量數據，并對測定結果進(jìn)行分析處理，及時(shí)對培養系統進(jìn)行反饋控制是成功進(jìn)行大規模動(dòng)物細胞培養的需要[[i]]。在培養過(guò)程中對于過(guò)程監測與控制具有重要意義同時(shí)又可在線(xiàn)測量的參數主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業(yè)上應用生物反應器進(jìn)行動(dòng)物細胞培養時(shí)，這些參數都是被在線(xiàn)測量的對象。溫度與PH值這兩個(gè)參數對于細胞而言是最基本的影響因素，而在控制時(shí)往往與其它參數相獨立。溫度的測量通常在生物反應器內部的單一位置，采用熱敏電阻檢測器（如Pt100熱電阻）進(jìn)行。PH值則多用復合式玻璃電極測量。Clark復膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測元件。所有此類(lèi)檢測元件都已成為生物反應器的標準配置。攪拌轉速的檢測一般是通過(guò)應用磁感應式，光感應式或測速發(fā)電機來(lái)實(shí)現的。磁感應式和光感應式檢測器是通過(guò)計測脈沖數來(lái)測量轉速的。安裝在攪拌軸或電機軸上的切片切割磁場(chǎng)或光束而產(chǎn)生脈沖電訊號，則脈沖頻率就反映了攪拌轉速的大小。而測速發(fā)電機是安裝在攪拌軸或電機軸上的小型發(fā)電機，它的輸出電壓和轉速間有良好的線(xiàn)性關(guān)系。補料速率直接影響到培養基中營(yíng)養物質(zhì)的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時(shí)間來(lái)計算，而泵的單位流量需在培養開(kāi)始前用補料管道進(jìn)行實(shí)際校準。如果不斷對補料瓶?jì)鹊氖Ｓ囿w積進(jìn)行監測，則可以得到足夠精確的補料數據來(lái)計算其他參數。對于通氣流量測定有多種不同的方法。根據作用原理，流量計可分成兩大類(lèi)型：體積流量型和質(zhì)量流量型。體積流量型是根據流體動(dòng)能的轉換以及流體流動(dòng)類(lèi)型的改變而設計的測量裝置。它會(huì )引起流體能量的不同程度的損失，而且測量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計和轉子流量計。質(zhì)量流量型是根據流體的固有性質(zhì)，如質(zhì)量、導電性、電磁感應性、離子化、熱傳導性能等進(jìn)行設計的流量計。如利用熱傳導性能對空氣進(jìn)行測量時(shí)沒(méi)有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對尾氣中O2與CO2濃度的測量上可以利用質(zhì)譜儀進(jìn)行，但實(shí)際生產(chǎn)與實(shí)驗中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進(jìn)行測定。2、狀態(tài)估計過(guò)程變量估計問(wèn)題大致可以分為兩類(lèi)：狀態(tài)估計和參數估計，所謂狀態(tài)變量即是指表示系統動(dòng)態(tài)過(guò)程的性態(tài)所需的一組最少數目的變量，它是描述過(guò)程內在本質(zhì)的，不一定是物理上可測的變量；而參數一般即指數學(xué)模型方程中待定的未知系數。狀態(tài)和參數的基本區別在于前者隨時(shí)間變化，而后者隨時(shí)間保持不變或緩慢變化。對細胞培養過(guò)程所處的狀態(tài)進(jìn)行分析時(shí)，最直接的方法就是通過(guò)在線(xiàn)測量獲得數據，再將其代入已有的過(guò)程模型中，從而得到關(guān)鍵狀態(tài)變量（如細胞密度、代謝速率、產(chǎn)物濃度等）的估計值。細胞在培養過(guò)程中，對環(huán)境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態(tài)估計所用的模型參數也處于不斷變化之中。故而狀態(tài)估計的問(wèn)題就在于如何從一個(gè)運行中的培養系統內不斷獲得必需狀態(tài)參數的修正值，從而利用在線(xiàn)測得的直接數據正確地分析培養過(guò)程所處的狀態(tài)。用于狀態(tài)估計的技術(shù)按照其性質(zhì)及在實(shí)踐中的應用可分為許多類(lèi)型。例如對系統本身及檢測數據時(shí)產(chǎn)生的隨機干擾噪聲采用的濾波技術(shù)，及針對動(dòng)態(tài)系統特性發(fā)展出的“推廣卡爾曼濾波”技術(shù)；應用非線(xiàn)性動(dòng)態(tài)系統模型以直接檢測數據推算不能夠直接檢測變量的技術(shù)；應用狀態(tài)觀(guān)測器以動(dòng)力學(xué)模型推測不能夠直接檢測變量的技術(shù)；應用連續參數估算器不斷調整過(guò)程模型中的參數以適應實(shí)際觀(guān)測數據，從而對狀態(tài)作出估計的技術(shù)等。3、過(guò)程控制的基本類(lèi)型控制系統在對培養參數進(jìn)行調整時(shí)可以采用許多模式�？傮w上可分為開(kāi)環(huán)（open-loop）控制系統與閉環(huán)（close-loop）控制系統。（1）開(kāi)環(huán)控制系統若系統的控制器與被控對象之間只有順向作用，沒(méi)有反向作用，即系統的輸出量對控制作用沒(méi)有影響，則稱(chēng)該系統為開(kāi)環(huán)控制系統。以細胞培養過(guò)程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規參數（溫度、攪拌、DO、pH等）穩定的同時(shí)，通過(guò)已建立的數學(xué)模型預測某一時(shí)間點(diǎn)細胞的生長(cháng)代謝狀態(tài)，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養基補加策略及成分調整的依據，在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之前作出調整。在這方面，關(guān)于雜交瘤生長(cháng)和單抗生成的多種數學(xué)模型已經(jīng)建立[[ii],[iii]]。系統化、結構化的補料策略也有了相當的發(fā)展[[iv],[v]]。但由于這種模式要求對細胞生長(cháng)和代謝的每一個(gè)細節都很清楚，在目前對生物體復雜的內在機理認識不足的情況下，理論預測與培養實(shí)踐仍有很大差距，這使得理論模型應用于實(shí)際生產(chǎn)受到了很大限制。（2）閉環(huán)控制系統系統的輸出量或狀態(tài)變量對控制作用有直接影響的系統稱(chēng)為閉環(huán)控制系統。閉環(huán)模式相對于開(kāi)環(huán)模式主要的區別是不需要建立模型去預測細胞和微環(huán)境將來(lái)的變化,而是通過(guò)在線(xiàn)(on-line)和/或離線(xiàn)(off-line)檢測手段獲得狀態(tài)數據，由人工或控制軟件根據當前值的變化即時(shí)調整培養設定參數，使培養系統始終處于最佳狀態(tài)。這種模式是在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之后作出調整，也稱(chēng)為反饋控制模式。細胞培養過(guò)程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環(huán)模式進(jìn)行的。同時(shí)由于控制的目的是減小實(shí)測值與設定值間的差距，因此屬于負反饋控制。針對動(dòng)物細胞培養，當前研究的方向有：利用攝氧速率（OUR）與底物消耗速率、副產(chǎn)物生成速率等參數綜合估算的結果來(lái)反饋調整營(yíng)養物的流加及培養基的灌流[[vi],[vii],[viii],[ix],[x]]；利用葡萄糖、谷氨酰胺等物質(zhì)的消耗速率及預先設定的濃度變化點(diǎn)來(lái)反饋調整營(yíng)養物流加速率[[xi]]；利用培養過(guò)程中各種相關(guān)物質(zhì)濃度間的比值設計出“軟探針”，并以此反饋控制培養過(guò)程[[xii]]。（3）PID(proportional integral derivative)控制模型在培養實(shí)踐中，一些狀態(tài)變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點(diǎn)上就可以滿(mǎn)足要求，則其控制采用“三點(diǎn)控制模式”即可。具體控制過(guò)程是首先以設定點(diǎn)為基準設置上、下限，當溫度高于/低于設定上限時(shí)啟動(dòng)/關(guān)閉冷卻系統，當溫度低于/高于設定下限時(shí)啟動(dòng)/關(guān)閉加熱系統，如此使溫度保持恒定。但在對更多的狀態(tài)變量（如PH，補料速率）進(jìn)行閉環(huán)控制時(shí)采用這種簡(jiǎn)單的方法會(huì )導致?tīng)顟B(tài)變量不斷地圍繞設定值波動(dòng)，對細胞的生長(cháng)與代謝產(chǎn)生不良影響。在利用閉環(huán)模式對培養系統進(jìn)行控制時(shí)，為有效而穩定地減小實(shí)測值與設定值間的偏差而免去人為的干預，自動(dòng)控制理論中一種狀態(tài)校正模式—PID(proportional integral derivative)控制模式便得到了廣泛的應用。它的微分方程表達式為式中u(t)為輸出值或設定值，e(t)為輸入值或實(shí)測值與設定值間的偏差，而式中的設計參數分別為比例增益KP、積分增益KI和微分增益KD。利用這種控制模式可以使系統在受干擾而發(fā)生波動(dòng)時(shí)盡快進(jìn)入穩定狀態(tài)，使細胞所受影響減到最低。具體的控制過(guò)程如圖所示，狀態(tài)變量在PID模式控制下隨時(shí)間進(jìn)行而趨于穩定：
| 設定值 |
[i]林福玉，陳紹烈，劉紅，等.大規模動(dòng)物細胞培養的問(wèn)題及對策.生物技術(shù)通報，1999，7(1):32-35[ii] Nielsen L.K.,et al.Avoiding rapid growth at high cell densities:a potentially important optimisation criterion for hybridoma cultures.Cytotechnology,1992,9:21-34.[iii]胡顯文，李佐虎，陳建新，等.氣液雙升式反應器動(dòng)物細胞培養及批式生長(cháng)動(dòng)力學(xué)模型.生物技術(shù)通訊，1999,10(2):104-108.[iv] C.S. Sanderson,et al.A structured, dynamic model for animal cell culture systems. Biochemical Engineering Journal,1999,3:203-211.[v] Christoph Herwig,et al.On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions.Biotech
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