生物醫學(xué)動(dòng)物實(shí)驗研究論文
1實(shí)驗設計
在開(kāi)展生物醫學(xué)研究時(shí)，研究者通過(guò)正確地運用統計學(xué)知識，可直接影響研究的質(zhì)量。統計學(xué)設計的任務(wù)在于對研究的部署、實(shí)施，直到研究結果的解釋進(jìn)行系統的安排，力爭做到以最少的人力、物力獲得可靠的結論和信息。其目的在于確定某種處理是否會(huì )表現出某種特定的效應。在實(shí)驗設計時(shí)應遵循惟一差異原則，即在進(jìn)行兩組比較時(shí)，兩者之間僅有因處理因素不同而引起的差異，而其他實(shí)驗條件相關(guān)的非處理因素都應保持等同。然而，處理組與對照組在反應上表現出的差別并不一定意味著(zhù)是處理的結果。另有兩種引起差別的可能性，即偏倚和偶然性。偏倚是指系統性差別，它不是因組間在處理上的不同所引起。生物醫學(xué)實(shí)驗中統計學(xué)設計和分析的目標就是消除潛在的偏倚，減少偶然性[2]。
1.1實(shí)驗的偏倚和控制
偏倚是在研究中從設計到實(shí)驗實(shí)施和結果分析的各環(huán)節存在一些人為的、有系統傾向的非隨機誤差，它不是由于抽樣造成的，而是某種偏性使得實(shí)驗結果偏離它的真值。從所選擇的生物醫學(xué)問(wèn)題到研究方案的制訂與實(shí)施、實(shí)驗的完成過(guò)程、實(shí)驗的分析與解釋?zhuān)酥翆?shí)驗結果的發(fā)表，均可能存在各式各樣的偏倚[2]。這種偏倚常常表現為系統誤差。偏倚的大小取決于研究的方法和具體的實(shí)驗條件。常見(jiàn)的偏倚主要有選擇性偏倚、觀(guān)察性偏倚和混雜性偏倚。必須認識實(shí)驗過(guò)程的偏倚，從實(shí)驗設計起直到整個(gè)研究過(guò)程結束均要加以控制。正確的實(shí)驗設計可控制選擇性的偏倚，事前人為控制和采取相應的措施可避免和減少觀(guān)察性的偏倚。對于混雜性偏倚，可將重要的混雜因素在設計階段進(jìn)行分層隨機設計，使混雜因素在組間分布均衡；在統計分析階段將混雜因素作為分層因素或采用有協(xié)變量分析方法，以消除混雜因素的影響。只有有效地控制或消除偏倚，方可減少結果的假陽(yáng)性或假陰性。
1.2減少偶然性的潛在影響
偶然性因素的作用可以減少，但不能完全排除。因為即使是在精心實(shí)施的研究中，接受同樣處理的動(dòng)物，其反應也不可能完全一樣。適當的統計分析可使實(shí)驗人員評估出現假陽(yáng)性的概率，即根本不存在處理效應的情況下觀(guān)察到差異的概率。這種概率越小，實(shí)驗者發(fā)現真實(shí)效應的可能性就越大。為了更有把握地檢測出真實(shí)效應，有必要減少偶然性的作用，并通過(guò)實(shí)驗設計確保能在“噪聲”之上識別真正的“信號”。
1.3實(shí)驗設計的要素
要消除生物醫學(xué)實(shí)驗中潛在的偏倚，減少偶然性，就應對實(shí)驗對象、處理因素和實(shí)驗效應這三個(gè)實(shí)驗設計要素，按照對照、重復、隨機化和均衡四項原則進(jìn)行周到的設計與控制[3]。1.3.1實(shí)驗對象實(shí)驗中處理因素所作用的對象稱(chēng)為實(shí)驗對象。不同性質(zhì)的實(shí)驗研究需要選取不同種類(lèi)的實(shí)驗對象，一個(gè)完整的實(shí)驗設計中所需實(shí)驗對象的總數稱(chēng)為樣本含量。生物醫學(xué)試驗中考慮動(dòng)物實(shí)驗對象時(shí)應關(guān)注以下幾個(gè)方面：①動(dòng)物種屬的選擇：選擇實(shí)驗動(dòng)物的種屬與品系時(shí)，尤其需要注意其背景反應的水平。為了將反應“信號”水平最大化，常常意味著(zhù)應避免選擇那些背景反應水平極低的動(dòng)物種屬或品系，但如果采用過(guò)度反應的動(dòng)物種屬或品系也同樣會(huì )出現問(wèn)題。動(dòng)物物種選擇中的其他問(wèn)題，無(wú)論是實(shí)際問(wèn)題（壽命、體型、易得性、對動(dòng)物學(xué)特征的了解情況）或是理論問(wèn)題（生化、生理或解剖結構與人的相似性），都需要從專(zhuān)業(yè)的角度認真加以考慮和權衡。②動(dòng)物的數量：雖然從統計設計角度考慮可得出某項實(shí)驗所需的動(dòng)物數（樣本含量），但所得出的數值往往很大。因此，雖然樣本含量估計是保證結論可靠性（精度和檢驗效能）的前提，但基于實(shí)驗的可操作性及經(jīng)濟原則方面的考慮，應結合統計學(xué)的計算結果與以往的生物醫學(xué)研究經(jīng)驗予以確定。③動(dòng)物的體重與年齡：為確保實(shí)驗對象的同質(zhì)性，實(shí)驗中所使用的動(dòng)物體重與年齡應盡可能相近；動(dòng)物體重的標準差不應超出平均值的10%；嚙齒類(lèi)等小動(dòng)物年齡相差不應超出1周，大動(dòng)物年齡相差不應超出1個(gè)月。④動(dòng)物的分層：為了準確檢測一種處理因素引起的差別，各處理組在可能影響實(shí)驗結果的其他非處理因素方面應盡可能具有同質(zhì)性。當存在動(dòng)物亞系間的差別時(shí)，有兩種方法可得到更為準確的結論。一是在結果分析階段將亞系作為一個(gè)“分層變量”處理，包括對兩個(gè)亞系的結果進(jìn)行單獨分析，然后將結果綜合，得出處理效應的總結論；二是將亞系作為實(shí)驗設計的“區組因素”，這種情況下可使對照組與處理組中每個(gè)亞系動(dòng)物數量相等。除以上所討論的“亞系”之外，其他的非處理因素，如性別、窩別、體重段等也可作為分層變量進(jìn)行局部控制，并據此進(jìn)行分層隨機化分組。1.3.2處理因素設計實(shí)驗研究時(shí)，要明確研究中的處理因素和影響實(shí)驗效應的非處理因素。研究者希望通過(guò)對研究設計進(jìn)行有計劃的安排，從而能科學(xué)地考察其效應大小的因素稱(chēng)為處理因素或實(shí)驗因素；研究者往往忽略對評價(jià)實(shí)驗因素作用大小有一定干擾的重要的非處理因素或非實(shí)驗因素（如動(dòng)物的窩別、體重等）；其他未加控制的許多因素的綜合作用統稱(chēng)為實(shí)驗誤差。實(shí)驗結果是處理因素和非處理因素共同作用而產(chǎn)生的實(shí)驗效應，因此如何控制和排除非處理因素的干擾，正確顯示處理的效應，是實(shí)驗設計的基本任務(wù)。1.3.3實(shí)驗效應實(shí)驗效應是處理因素作用于受試對象的反應和結果，是反映實(shí)驗因素作用強弱的標志，它通過(guò)觀(guān)察指標（統計學(xué)常將指標稱(chēng)為變量）來(lái)體現。如果指標選擇不當，未能準確反映處理因素的作用，獲得的研究結果就缺乏科學(xué)性，因此選擇好觀(guān)察指標是關(guān)系整個(gè)研究成敗的重要環(huán)節。指標的觀(guān)察應避免帶有偏性或偏倚，要結合專(zhuān)業(yè)知識，盡可能多地選用客觀(guān)性強的指標，在儀器和試劑允許的條件下，應盡可能多選用特異性強、靈敏度高、準確可靠的客觀(guān)指標。對一些半客觀(guān)（如尿液pH試紙讀數值）或主觀(guān)指標（行為測量、病理觀(guān)察），一定要事先規定讀取數值的嚴格標準，只有這樣才能準確地分析實(shí)驗結果，從而提高實(shí)驗結果的可信度。
1.4實(shí)驗設計的原則
為了防止結果的偏倚，保證實(shí)驗結果的準確性和最大化的表達，在進(jìn)行生物醫學(xué)實(shí)驗設計時(shí)必須遵循統計學(xué)設計的對照、重復、隨機化和均衡四個(gè)基本原則。生物醫學(xué)實(shí)驗中對照組的設置必須具備三個(gè)條件：①對等原則，即惟一差別原則，除處理因素外，對照組具備與實(shí)驗組對等的非處理因素。在相互比較的各組間，除了給予的處理因素不同外，其他方面應與實(shí)驗組具有一致性，如相同的實(shí)驗單位來(lái)源（動(dòng)物種屬、體重等）和相同的實(shí)驗條件、操作方式和喂養環(huán)境等。②同步原則，對照組與實(shí)驗組設立之后，在整個(gè)研究進(jìn)程中始終處于同一空間和同一時(shí)間。③專(zhuān)設原則，任何一個(gè)對照組都是為相應的實(shí)驗組專(zhuān)門(mén)設立的。不得借用文獻上的記載或以往結果或其他研究資料作為本研究之對照。
1.5生物醫學(xué)中常用的實(shí)驗設計類(lèi)型
如果需要在同一實(shí)驗中同時(shí)評價(jià)幾種不同的效應，實(shí)驗者應該安排能區別各自效應差別的實(shí)驗設計方法。生物醫學(xué)中常用的實(shí)驗設計有以下幾項。1.5.1完全隨機設計完全隨機設計是生物醫學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中最為常用的一種實(shí)驗設計方法，它是一種單因素有k個(gè)水平（k≥2）組的實(shí)驗設計。即實(shí)驗設計可設置一個(gè)對照或多個(gè)劑量組的實(shí)驗方案。本設計保證每個(gè)實(shí)驗動(dòng)物都有相同機會(huì )接受任何一種處理，而不受實(shí)驗人員主觀(guān)傾向的影響。本設計應用了重復和隨機化兩個(gè)原則，因此能使實(shí)驗結果受非處理因素的影響基本一致，真實(shí)反映出實(shí)驗的處理效應。1.5.2隨機區組設計隨機化完全區組設計，簡(jiǎn)稱(chēng)隨機區組設計，又稱(chēng)配伍組設計，是配對設計的擴展，它將幾個(gè)條件相同的受試者劃分在同一個(gè)區組或配伍組，然后再按隨機的原則，將同一配伍組的受試者隨機分配到各實(shí)驗組。該設計方法的優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)區組內的k個(gè)實(shí)驗單位有較好的同質(zhì)性，比完全隨機設計更容易察覺(jué)處理間的差別。這種方法須特別注意的是要求區組內實(shí)驗單位數與處理數相同，實(shí)驗結果中若有缺失值，統計分析將損失部分信息。1.5.3拉丁方設計拉丁方設計從橫行和直列兩個(gè)方向進(jìn)行雙重局部控制，使得橫行和直列兩向皆成區組，是比隨機區組設計多一個(gè)區組因素的設計。在拉丁方設計中，每一行或每一列都成為一個(gè)完全區組，而每一處理在每一行或每一列都只出現一次，也就是說(shuō)，在拉丁方設計中，實(shí)驗處理數=橫行區組數=直列區組數=實(shí)驗處理的重復數。1.5.4析因設計析因實(shí)驗設計又稱(chēng)全因子實(shí)驗設計，屬于多因素、多水平單效應的設計。它不僅可以檢驗每一因素各水平之間的效應差異，而且可以檢驗各因素之間的交互作用。交互作用是指一個(gè)因素不同水平間的效應差受另一因素的影響，包括協(xié)同交互作用和拮抗交互作用。析因實(shí)驗主要用于分析交互作用，當因素及水平數過(guò)多時(shí)，所需的實(shí)驗對象數、處理組數和實(shí)驗次數大幅度增加，故一般采用較簡(jiǎn)單的析因實(shí)驗。含有較多因素和水平的實(shí)驗一般采用正交實(shí)驗設計[5]。
2生物醫學(xué)動(dòng)物實(shí)驗的描述統計學(xué)
2.1生物醫學(xué)實(shí)驗資料的類(lèi)型
生物醫學(xué)實(shí)驗對實(shí)驗對象（動(dòng)物）進(jìn)行干預后測定的觀(guān)測指標通常有以下類(lèi)型：①連續性數據：測定結果表現為有數字大小和單位的數據，統計上稱(chēng)定量資料，如生理、生化指標，體重值，器官重量等。②分類(lèi)數據：測定結果表現為按某屬性劃分的定性類(lèi)別，統計上稱(chēng)為定性資料，具體又可以分為二值資料、多值名義資料和多值有序資料。如某反應為出現或不出現，死亡或未死亡，有畸形或無(wú)畸形；病理?yè)p害的嚴重程度（無(wú)、輕度、中度、重度）等。
2.2統計描述指標
描述性統計學(xué)（或歸納統計學(xué)）是對樣本觀(guān)察/測量數據頻率分布的定量研究，描述性統計的目的在于：①對測量值或觀(guān)察值進(jìn)行歸納濃縮，用統計量、統計圖或統計表的形式表現；②估計總體分布的參數。2.2.1資料的整理與探索對于某一測量指標，一般應從文獻資料中了解其分布類(lèi)型。如果沒(méi)有判斷概率分布的理論基礎，應重復以大樣本測定，繪制樣本的頻數分布圖（理論上樣本量要大于100），并經(jīng)統計學(xué)檢驗擬合其分布。2.2.2數據的描述統計量①連續性數據的頻數分布：通過(guò)對樣本資料編制頻數分布表或做莖葉圖，以確定資料分布的類(lèi)型、頻數分布的集中趨勢和離散趨勢、估計總體參數，也便于發(fā)現離群值。②中心位置的描述統計量：描述數據分布的集中趨勢，常用指標為算術(shù)均數、中位數、眾數、幾何均數等。③離散程度的描述統計量：描述數據分布的離散趨勢，常用指標為標準差和方差、極差和四分位數間距、變異系數和離散系數等。④統計學(xué)圖表：統計圖包括連續性數據分布的直方圖、莖葉圖，表示數據中心位置和離散程度的點(diǎn)桿圖（做圖時(shí)表示均數和標準差）和盒須圖（做圖時(shí)表示中位數、極差、四分位數間距），描述構成比數據資料的百分條圖、餅圖，描述經(jīng)時(shí)變化趨勢的線(xiàn)圖，以及預測和檢驗分布類(lèi)型的概率-概率圖（P-P圖）等[6]。統計表具有簡(jiǎn)單、明了、易于理解、便于比較的優(yōu)點(diǎn)。編制統計表時(shí)原則上應當重點(diǎn)突出、層次分明、避免層次過(guò)多或結構混亂。一般的統計表應為三線(xiàn)表，表中只有橫線(xiàn)，無(wú)豎線(xiàn)和斜線(xiàn)。統計表的標目應層次清楚，不宜過(guò)于復雜。
3生物醫學(xué)動(dòng)物實(shí)驗的假設檢驗
生物醫學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中最常見(jiàn)的情況是給予不同受試物后進(jìn)行組間比較，通過(guò)統計學(xué)中的假設檢驗，說(shuō)明受試物的作用。假設檢驗時(shí)應注意以下問(wèn)題。
3.1檢驗方法的選用依據
3.1.1資料的類(lèi)型和變量的數目不同類(lèi)型的資料（定量、定性）的組間比較應采用不同的統計檢驗方法。單變量、多變量的統計檢驗方法也各不相同。3.1.2實(shí)驗設計類(lèi)型應該根據實(shí)驗設計的具體類(lèi)型選擇對應的統計檢驗方法，以便得到處理組效應的真實(shí)結論。3.1.3檢驗方法的前提條件選用假設檢驗方法前，應了解所分析的數據資料是否滿(mǎn)足相應檢驗方法的前提條件，如t檢驗和方差分析等參數檢驗方法要求數據滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性，2檢驗要求樣本含量大于40且理論頻數大于5。
3.2正態(tài)性檢驗及擬合優(yōu)度檢驗
統計學(xué)假設檢驗須判定樣本的頻數分布是否符合某一理論分布，如符合要求就可按此理論分布來(lái)進(jìn)行統計學(xué)處理。對正態(tài)分布可采用正態(tài)性檢驗，其他分布可用擬合優(yōu)度檢驗。通�？赏ㄟ^(guò)查閱文獻，了解實(shí)驗參數符合何種理論分布。
3.3方差齊性檢驗
連續性數據未達到參數法統計分析前提的第二種原因即為方差不齊。一般而言，數值愈大，其固有的變異性也愈大。例如，若某組動(dòng)物的平均反應值為100，其數值范圍可能為80~120；而另一組動(dòng)物的平均反應值為300，其數值范圍可能會(huì )擴大至240~360。解決方差不齊的措施是進(jìn)行數據轉換。若數據的標準差與平均值成正比，在統計分析前宜將數據轉換為對數值之后再進(jìn)行分析，據此，不僅數據的變異度與平均值大小無(wú)關(guān)，同時(shí)還可確保其更符合正態(tài)分布。若數據變異度增加幅度與平均值的關(guān)系不太明顯，采用平方根轉換則更易使數據的變異度與平均值大小無(wú)關(guān)。某些數據經(jīng)對數或平方根轉換后可能仍存在方差不齊，此時(shí)宜采用非參數檢驗。
3.4單側檢驗與雙側檢驗
檢驗假設選擇單側檢驗或雙側檢驗，應事先根據專(zhuān)業(yè)知識做出選擇。一般而言，若研究目的僅須了解是否存在組間差異、實(shí)驗者無(wú)法預測組間變化的方向以及實(shí)驗者希望獲得正負兩方面的結果時(shí)，應采用雙側檢驗。若事先可預測組間差異的變化方向，實(shí)驗者僅對某一方面的重要性感興趣，實(shí)驗者僅希望了解與對照組差異或正或負一個(gè)方向，則應采用單側檢驗。此外，劑量設計預試驗中應采用雙側檢驗，正式試驗在了解相關(guān)信息后可采用單側檢驗。
3.5多重比較及多重性問(wèn)題
生物醫學(xué)實(shí)驗經(jīng)常在處理組和對照組之間做多個(gè)變量的比較。即使不存在真正的實(shí)驗效應，也有可能純粹由于偶然性而有一個(gè)或多個(gè)變量在5%檢驗水平出現顯著(zhù)性差別。除了上述均數多重比較導致Ⅰ類(lèi)錯誤概率增加的多重性問(wèn)題之外，其他的多重性問(wèn)題還包括多次的中期分析、關(guān)注多個(gè)結局、亞組間的多重比較。處理多重性問(wèn)題的原則包括：①預先計劃進(jìn)行多重比較；②限制比較的次數；③多重比較時(shí)采用更嚴格的界值標準；④多重比較具有生物學(xué)方面的依據。
3.6觀(guān)察值或實(shí)驗對象的獨立性
許多統計檢驗方法要求比較的觀(guān)察值或實(shí)驗對象相互獨立，如二項分布的率檢驗、t檢驗和方差分析等。但是，有的生物醫學(xué)實(shí)驗中觀(guān)察單位并不獨立。例如，生殖和發(fā)育研究中就存在窩效應：由于遺傳因素、宮內的發(fā)育環(huán)境和藥物的代謝環(huán)境相似，與異窩胎仔相比，同窩胎仔之間對毒性效應的反應概率趨于系統，即同窩內數據為聚集性數據，這就是一種常見(jiàn)的非獨立數據。在統計學(xué)分析時(shí)，忽略數據的窩內相關(guān)性具有潛在的風(fēng)險；因同窩母鼠所產(chǎn)k個(gè)胎仔的觀(guān)察值存在共性，其所提供的信息不及k個(gè)獨立的來(lái)自不同母鼠所產(chǎn)胎仔所提供的信息；窩內相關(guān)性愈大，其信息量愈少。聚集性數據的均數標準誤小于獨立的數據，因此，若基于觀(guān)察值獨立的統計分析方法，就會(huì )增加犯Ⅰ類(lèi)錯誤的概率，即假陽(yáng)性的風(fēng)險增加，降低實(shí)驗的有效性。
3.7歷史對照數據的應用
某些情況下，尤其是在發(fā)生率較低的情況下，單項研究可能提示處理可影響腫瘤發(fā)生率，但無(wú)法得出明確的結論�？赡芟氲降姆治鲛k法之一是將處理組的數據與來(lái)自其他研究的對照組動(dòng)物相比較。雖然歷史對照數據具有重要意義，但值得強調的是，眾多原因可導致不同研究之間的變異度大于研究之內的變異度。動(dòng)物來(lái)源、飼料及飼養條件，研究期限，研究中的動(dòng)物死亡率、讀片的病理學(xué)家等均可能影響最終的腫瘤發(fā)生率。故此，忽視這些差異，將處理組的腫瘤發(fā)生率與合并的對照組發(fā)生率相比較，可能得出嚴重錯誤的結果，并進(jìn)而明顯夸大統計顯著(zhù)性水平。Tarone[4]曾對歷史對照組的比率數據分析進(jìn)行過(guò)綜述。
3.8假設檢驗的局限性
首先，假設檢驗中的P值并未提供有關(guān)處理誘發(fā)效應大小的直接信息。某一受試物可誘發(fā)一定量的、反應的增加，但增加的幅度是否具有統計顯著(zhù)性則取決于研究的規模和數據的變異性。在規模較小的研究中，有可能錯失較大、重要的效應，尤其是在檢測終點(diǎn)測量精度不高的情況下。相反，在規模較大的研究中，較小、非重要的效應則具有統計顯著(zhù)性。例如，D藥與C藥相比，降血壓效應相差近30mmHg，但因為例數僅10例，假設檢驗未發(fā)現顯著(zhù)性差異（P=0.31）；相反，B藥與A藥相比，降血壓效應僅相差0.2mmHg，但因為例數達500例，假設檢驗卻發(fā)現存在顯著(zhù)性差異（P<0.001）。由此可見(jiàn)，統計學(xué)顯著(zhù)性與效應大小無(wú)直接相關(guān)性。因此，愈來(lái)愈多的統計學(xué)家主張以處理組與對照組差異值的95%置信區間表述處理的效應。據此，若處理反應的增加值為10個(gè)單位（95%置信區間3~17單位），則該區間包含真實(shí)差異的幾率為95%。若置信區間的下限大于零，則雙側檢驗的P值小于0.05。其次，假設檢驗無(wú)法消除實(shí)驗設計或實(shí)施不當所帶來(lái)的影響。雖然前述的分層分析等有助于發(fā)現真實(shí)的差異，但若實(shí)驗設計存在偏倚，或實(shí)驗實(shí)施過(guò)程中存在偏差或失誤，假設檢驗方法一般也于事無(wú)補。因此，在生物醫學(xué)實(shí)驗過(guò)程中應注重對實(shí)驗設計或實(shí)施過(guò)程進(jìn)行嚴格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證措施，強化GLP規范意識。其三，對統計學(xué)分析本身的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證也是確保研究質(zhì)量的重要環(huán)節。所用統計分析軟件包應經(jīng)過(guò)充分的認證，以確保分析結果的準確、可靠性。數據的錄入、核對和分析結果的報告與歸檔，均應制訂并嚴格執行相關(guān)的標準操作規程。綜上所述，在動(dòng)物實(shí)驗研究的多個(gè)環(huán)節，統計學(xué)中的相關(guān)理論和方法都能夠發(fā)揮重要作用。統計學(xué)不僅可以保證結果的科學(xué)性和可靠性，在很多情況下也可以極大地提高研究效率，節約研究成本。在這里還必須強調，除了實(shí)驗后期的數據分析以外，在實(shí)驗方案的制定階段也需要統計學(xué)人員的早期介入，這樣有助于避免實(shí)驗設計出現大的偏差和漏洞，有利于研究目標的順利實(shí)現。
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