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生物正交氧化還原體系的構建及意義
正交氧化還原體系對提高輔因子調控效率和可預見(jiàn)性具有重要意義，有利于提高外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性，下面是小編搜集的一篇探究生物正交氧化還原體系的論文范文，歡迎閱讀查看。
細胞內代謝過(guò)程除以碳骨架結構改變?yōu)橹鞯奈镔|(zhì)轉化外，通常還伴隨輔因子介導的能量轉移。物質(zhì)轉化和能量轉移高度耦合，顯著(zhù)增加了代謝系統的復雜度。氧化還原輔因子通過(guò)在氧化態(tài)和還原態(tài)之間循環(huán)再生傳遞電子，將物質(zhì)轉化途徑關(guān)聯(lián)成復雜的代謝網(wǎng)絡(luò )[1].據不完全統計，在微生物中僅吡啶核苷酸輔酶(nicotinamideadeninedinucleotide(phosphate)，NAD(P))及其還原態(tài)參與的生化反應就超過(guò)1000種[2],這還不包括它們參與的其他生物學(xué)過(guò)程。傳統生物化學(xué)研究提供了大量生物學(xué)元件[3,4],系統生物學(xué)研究建立了各種代謝模型[5,6],分子生物學(xué)發(fā)展提供了有效的遺傳操作方法，使設計和構建新的高效、受控的物質(zhì)轉化途徑成為可能。然而，輔因子在代謝網(wǎng)絡(luò )中的節點(diǎn)作用使各種生化反應建立起復雜的相互作用網(wǎng)絡(luò )，極大地影響了外源途徑在底盤(pán)細胞代謝環(huán)境中的功能。以氧化還原代謝為例，新途徑可能破壞宿主內源氧化還原平衡，從而抑制生長(cháng)，使新途徑難以產(chǎn)生預期效果[7].人工構建的外源途徑對底盤(pán)細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò )的相互干擾，特別是氧化還原環(huán)境的干擾，是影響外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性的重要因素。通過(guò)調節胞內輔因子水平，如控制酶的表達水平、優(yōu)化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競爭代謝途徑等，可以?xún)?yōu)化外源途徑與底盤(pán)細胞的適配性，在一定程度上提高代謝調控效率[8~10].但輔因子擾動(dòng)的生物學(xué)效應的可控性和可預見(jiàn)性低。例如，琥珀酸生產(chǎn)需要維持胞內較高NADH水平，但高NADH水平影響菌株對培養條件的適應性[11].設計脂肪酸生產(chǎn)菌株時(shí)需要使脂肪酸合成途徑與宿主NADPH供給能力相匹配，但由于無(wú)法確定擾動(dòng)NADPH水平對代謝造成的全局性影響，無(wú)法預測合適的外源基因表達強度，需要篩選不同表達強度的啟動(dòng)子表達外源基因[12].輔因子關(guān)聯(lián)作用導致的復雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。例如，在大腸桿菌(Escherichiacoli)中構建的高效丁醇合成途徑,移植到藍細菌(Cyanobacteria)中就難以達到積累丁醇的效果，因為藍細菌傾向于積累NADPH而非NADH[13,14].
因此，提高人工代謝途徑在底盤(pán)細胞中的適配性、可預見(jiàn)性和可移植性需要降低代謝系統，特別是輔因子依賴(lài)型氧化還原系統的復雜度。
1正交氧化還原體系
為降低代謝系統復雜度，可設計獨立于生長(cháng)代謝的合成途徑及獨立的輔因子循環(huán)再生體系。這種在復雜代謝體系中執行系統子功能，并且其執行過(guò)程獨立于系統其他組件的子系統稱(chēng)為正交體系。正交體系的設計構建過(guò)程即“正交化”[15].正交氧化還原體系是指電子傳遞獨立于系統其他氧化還原輔因子系統的一種氧化還原體系。目前主要有兩種策略可用于構建正交氧化還原體系：(ⅰ)在空間上分隔輔因子依賴(lài)型體系，即“空間正交氧化還原體系”;(ⅱ)構建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系，即“生物正交氧化還原體系”[8,15].設計構建正交氧化還原體系，是減少外源途徑對底盤(pán)細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò )的干擾，提高外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性的重要策略。以下綜述正交氧化還原體系的設計和應用特點(diǎn)。
2空間正交氧化還原體系
空間正交氧化還原體系通過(guò)將相關(guān)的酶及輔因子限定在特定區域，提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統的相互作用[16,17],目前主要通過(guò)構建融合蛋白和設計蛋白錨定支架實(shí)現，并已有多個(gè)成功應用的報道。另外，最近發(fā)現，細胞內可形成一些特殊的微區室(microcompartment)，可以有效限制輔因子或代謝中間體擴散，從而避免胞內輔因子水平干擾微區室內氧化還原代謝[18,19].利用微區室也可構建空間正交氧化還原體系[15].
蛋白融合技術(shù)通過(guò)基因工程手段將多個(gè)酶用短肽序列連接形成融合蛋白，通過(guò)調整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位(圖1A)，優(yōu)化級聯(lián)催化過(guò)程中底物和能量傳遞[20].蛋白錨定支架技術(shù)通過(guò)調整支架上的錨定位點(diǎn)距離、各種錨定位點(diǎn)的數量和連接肽特性3種方式調整酶的空間定位和比例(圖1B)，可降低代謝網(wǎng)絡(luò )對目標途徑的影響，提高目標途徑底物和輔因子的局部濃度，減少與環(huán)境的相互影響[21].
兩種空間正交氧化還原體系構建策略都受到連接肽特性的影響，由于連接肽及蛋白結構和功能的多樣性，需要通過(guò)篩選確定合適的連接肽柔性和長(cháng)度，優(yōu)化酶的空間定位[2,22].連接肽通常使用柔性序列GGGGS(G4S)[23~26],通過(guò)調整其拷貝數改變連接肽長(cháng)度，但有時(shí)利用剛性氨基酸延長(cháng)連接肽效果更好，如將惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)細胞色素P450(P450cam)、假單胞氧還蛋白(putidaredoxin,PdX)和假單胞氧還蛋白還原酶(putidaredoxinreductase,PdR)分別與硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)融合時(shí)，比較兩組連接肽G4S-(P5)n-G4S(n=1~5)和(G4S)n(n=1~6)效果，以G4S-(P5)4-G4S連接時(shí)活性最高((6.5±0.3)μmol/(Lmin))，而(G4S)n(n=1~6)最高活性(G4S)5約為5μmol/(Lmin)[22].相比于柔性，調節連接肽長(cháng)度效果通常更顯著(zhù)，上述實(shí)例中最適連接肽長(cháng)度對應活性比n=1時(shí)提高兩倍。
長(cháng)度選擇也是最常見(jiàn)的連接肽優(yōu)化方式。在P450單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC,催化桉樹(shù)醇轉化為2-羥基-桉樹(shù)醇，發(fā)現當連接肽長(cháng)度為10個(gè)氨基酸時(shí)產(chǎn)量最高，少于4個(gè)氨基酸時(shí)檢測不到催化活性[2].
除了連接肽特性，空間正交氧化還原體系構建還需要綜合優(yōu)化多種因素以在提高體系獨立性的同時(shí)獲得更好的催化活性。構建融合蛋白要考慮融合方向對催化效率的影響.將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)來(lái)源的氫酶(hydrogenase,H2ase)融合鐵氧還蛋白(ferredoxin,FD)促進(jìn)產(chǎn)氫時(shí)，用2個(gè)氨基酸殘基連接時(shí)，FD連在H2ase的C-末端對產(chǎn)氫過(guò)程無(wú)促進(jìn)作用，而連在N-末端氫氣產(chǎn)量提高約3倍[26].這是因為H2ase與FD作用位點(diǎn)在氫酶N-末端，N-末端融合更利于兩個(gè)蛋白相互作用。這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長(cháng)度的影響，以14個(gè)氨基酸殘基連接效果最好，產(chǎn)氫效率提高近5倍，延長(cháng)至46個(gè)氨基酸殘基幾乎沒(méi)有促進(jìn)作用[26].
與蛋白融合技術(shù)相比蛋白錨定支架技術(shù)可更自如地設計酶的空間分布和計量關(guān)系[27,28].仍以上述H2ase與FD生物轉化產(chǎn)氫途徑為例：將真核信號轉導相關(guān)的PDZ(postsynapticdensityproteinof95kilodaltons,disclarge,zonaoccludens-1)，SH3(sarcomahomology3)和GBD(gelatinbindingdomain)3種結構域整合到支架蛋白上，通過(guò)配體肽段將催化生物合成的酶特異性結合到支架蛋白的對應位置，這種設計可以通過(guò)調整H2ase和FD在支架上的結合位置、酶與支架配體間連接肽的長(cháng)度、結合域數量等調整酶的空間分布與比例[26].結合域在支架上間距靠近時(shí)產(chǎn)氫效率高;結合域相對位置相同，FD與支架蛋配體白的連接肽長(cháng)度分別為10,20,40個(gè)氨基酸時(shí)，延長(cháng)肽鏈長(cháng)度可使氫氣產(chǎn)量提高3~5倍;通過(guò)調整支架蛋白上的PDZ,SH3和GBD結合域比例調整FD:H2ase比率，比率越小產(chǎn)氫效率越高[26].
除了蛋白，DNA,RNA等大分子也可作為蛋白錨定支架[20,29,30],并且隨著(zhù)DNA合成技術(shù)發(fā)展及對DNA,RNA結構預測能力的提高，基于核酸的支架受到更多重視。利用DNA整合NAD(P)H:黃素單核苷酸(flavinmononucleotide,FMN)氧化還原酶和熒光素酶，還原力NADH經(jīng)過(guò)NAD(P)H:FMN氧化還原酶傳遞給FMN,然后傳遞給熒光素酶，與分別連在兩條不同DNA鏈上的游離狀態(tài)相比，連在同一DNA鏈上時(shí)活性提高到2~3倍[31].支架可以是單個(gè)分子，也可以是可自組裝的蛋白亞基。如將前述P450cam,PdX,PdR和亞磷酸脫氫酶分別與PCNA融合時(shí)，構建融合蛋白PCNA-PdR,PCNA-P450cam和PTDH-PCNA-PdX,3個(gè)融合蛋白的PCNA亞基通過(guò)自組裝形成三聚體將4個(gè)酶進(jìn)行空間整合，促進(jìn)反應中的電子傳遞，組裝復合體比游離酶催化速率提高2倍[22,32].
以上空間正交氧化還原體系的應用表明，通過(guò)減少天然氧化還原體系的干擾，可以有效提高目標氧化還原體系的效率和可預見(jiàn)性。
3生物正交氧化還原體系
空間正交氧化還原體系通過(guò)限制環(huán)境因素對體系的影響提高催化效率和可控性，仍然難以避免天然輔因子與底盤(pán)細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò )的相互影響。如果突破相應生物化學(xué)反應對天然輔因子的依賴(lài)，建立生物正交氧化還原體系，將可能從根本上解決能量特異性傳遞問(wèn)題。
3.1生物正交氧化還原體系構建
構建生物正交氧化還原體系，需要合成不被天然代謝系統識別的人工輔因子，并獲得特異性識別人工輔因子的突變型酶，組成具有催化功能的配對[15,33].利用蛋白工程和化學(xué)生物學(xué)方法，構建獨立于天然生物反應的非天然配體/受體配對，即生物正交體系，已取得過(guò)一些降低生物體系復雜度的成功例子[34,35].
生物正交的配體/受體配對設計策略可分為兩種：(ⅰ)策略以配體改造為中心，即先改造受體并篩選獲得不識別天然配體的新受體，再合成具有一定結構多樣性的配體類(lèi)似物文庫，然后篩選得到該新受體與特定配體類(lèi)似物配對的功能組合;(ⅱ)策略以受體改造為中心，即先選定一種不被天然受體利用的配體類(lèi)似物，再構建受體文庫，然后篩選得到該配體類(lèi)似物與新受體的配對功能組合[36].
以設計篩選NAD類(lèi)似物-依賴(lài)型氧化還原酶為例，說(shuō)明正交氧化還原體系構建過(guò)程[33].對于NAD分子，可認為由單磷酸腺苷(adenosinemonopho-sphate,AMP)和煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide,NMN)兩部分組成(圖2A)，其中NMN參與電子傳遞，而AMP部分參與分子識別，對輔因子特異性有重要影響[37].改造NAD結構的腺嘌呤環(huán)部分，可在保留電子傳遞功能的同時(shí)改變其與受體相互作用。因此，以其他雜環(huán)代替腺嘌呤環(huán)部分合成一系列NAD類(lèi)似物，同時(shí)以NAD依賴(lài)型蘋(píng)果酸酶(malicenzyme,ME)為例構建其突變體表達文庫。利用以上合成的特定NAD類(lèi)似物為輔因子，篩選ME突變體文庫，得到具有催化活性的功能配對[33,38,39].
以5-氟代胞嘧啶環(huán)代替腺嘌呤環(huán)的類(lèi)似物煙酰胺氟代胞嘧啶二核苷酸(nicotinamideflucytosinedinucleotide,NFCD)(圖2B)為輔因子，野生型ME催化效率僅為以NAD為輔因子時(shí)的0.93%.在ME突變文庫中篩選利用NFCD的突變體ME*(MEL310R/Q401C)，ME*以NFCD為輔因子的催化效率與野生型組合相當，而以NAD為輔因子的催化效率僅為以NFCD為輔因子的0.37%.而且，ME*保留了對底物蘋(píng)果酸的立體選擇性。因此，ME*-NFCD組合可作為生物正交化氧化還原體系執行天然的ME-NAD體系的催化功能[33].進(jìn)一步合成了其他NAD類(lèi)似物(圖3B)，發(fā)現ME*與NBrCD配對的催化效率可達到野生型配對催化活性的73%.表明NAD類(lèi)似物與ME*組成的配對可達到與天然體系相近的催化效率，即構建了不依賴(lài)天然輔因子的正交氧化還原體系[39].
基于NFCD類(lèi)似物(NFCDanalog,NXCD)的正交氧化還原體系構建策略具有可擴展性。氧化還原酶與NAD的結合區域通常具有保守的Rossmann折疊結構[40].ME*的關(guān)鍵突變位點(diǎn)L310位于其保守序列GX(X)GXXG的N-末端，對蘋(píng)果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的相應保守位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，均獲得了偏好NFCD的突變體[33].說(shuō)明同樣的突變策略可應用于改造其他吡啶核苷酸輔酶依賴(lài)型氧化還原酶，構建相應的正交反應體系。
構建生物正交氧化還原體系的難點(diǎn)在于設計篩選生物正交的配體-蛋白組合。雖然不斷完善的配體-蛋白組合輔助設計工具降低了工作難度[41~43],獲取高活性配體-蛋白組合仍需高通量篩選策略[44].由于氧化還原酶具有較高的結構保守性[40],識別NAD類(lèi)似物所蘊涵的信息可用于指導改造其他氧化還原酶。目前使用的NXCD系列類(lèi)似物合成成本較高，使用過(guò)程中可以選擇循環(huán)再生策略降低使用成本[33].
3.2生物正交氧化還原體系的應用
由于正交氧化還原體系獨立于天然輔因子循環(huán)體系，可進(jìn)行途徑特異性還原力傳遞，因此理論上可用表達突變型功能酶的粗酶液進(jìn)行選擇性生物轉化。
以大腸桿菌細胞裂解液催化轉化蘋(píng)果酸生產(chǎn)丙酮酸為例，對于表達野生蘋(píng)果酸酶的體系，在NAD存在下，蘋(píng)果酸氧化脫羧生成丙酮酸并伴生NADH[45].而內源的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)以NADH為輔因子，進(jìn)一步將丙酮酸還原為乳酸(圖3A)。丙酮酸和乳酸收率分別為70%和26%,即26%丙酮酸被轉化成乳酸。而利用過(guò)表達ME*的粗酶液在外加NFCD的條件下，丙酮酸收率達到79%時(shí)，乳酸收率僅為5%.這是因為，內源乳酸脫氫酶難以利用NFCDH為輔因子還原丙酮酸(圖3B)。
可見(jiàn)，利用生物正交氧化還原體系，可以使電子特異性地在該體系內部傳遞，避免與內源途徑相互干擾，提高體系效率的同時(shí)排除副反應。這一特性表明正交氧化還原體系可降低外源途徑與底盤(pán)細胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò )的相互干擾，提高外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性。由于目前還沒(méi)有在胞內檢測到NXCD的相關(guān)報道，應用正交氧化還原體系需要解決將NXCD導入胞內的問(wèn)題。通過(guò)化學(xué)合成獲得NXCD,再利用細胞透性化技術(shù)或轉運蛋白[48~50]可將NXCD導入細胞。
作者近期利用擬南芥(Arabidopsisthaliana)來(lái)源的NAD轉運蛋白[50]將胞外NCD導入大腸桿菌工程菌，成功地在胞內構建生物正交氧化還原體系[51].該體系利用突變型亞磷酸脫氫酶氧化亞磷酸再生NCDH,NCDH特異性推動(dòng)ME*催化丙酮酸還原羧化產(chǎn)生蘋(píng)果酸[51,52].而對于天然體系，由于NADH被天然代謝系統消耗，ME利用NAD催化蘋(píng)果酸氧化脫羧反應。這些結果表明，基于NCD的正交體系可有效避免與天然體系相互干擾，選擇性傳遞氧化還原力。正交氧化還原體系的應用將顯著(zhù)提高外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性。
4展望
正交氧化還原體系對提高輔因子調控效率和可預見(jiàn)性具有重要意義，有利于提高外源合成途徑與底盤(pán)細胞適配性�？赏ㄟ^(guò)空間正交化和生物正交化兩種策略構建正交氧化還原體系。其中空間正交化策略在空間上隔離輔因子依賴(lài)型代謝反應，其推廣應用依賴(lài)于發(fā)現更高效的蛋白錨定支架系統或組裝新的微區室。生物正交化策略可從根本上解決輔因子依賴(lài)型反應相互干擾的問(wèn)題，是輔因子調控技術(shù)發(fā)展的重要方向，其發(fā)展依賴(lài)于分子間相互作用的分析設計能力和配體/受體組合的篩選能力，以獲得功能更豐富的生物正交氧化還原體系，并提高生物正交特異性。其中在NCD基礎上設計煙酰胺胞嘧啶二核苷酸磷酸(nicotinamidecytosinedinucleotidephosphate,NCDP)化學(xué)合成或生物合成途徑，并篩選構建NCDP-功能酶正交組合，將極大地提高生物正交氧化還原體系組件的設計構建效率，提供多種輔因子水平和氧化還原狀態(tài)選擇，為基于生物正交氧化還原體系的代謝途徑設計提供更廣闊的應用和研究空間。
正交氧化還原體系提供了一種提高胞內輔因子調控效率和可預見(jiàn)性的新思路，與其他工程策略組合使用，對設計微生物細胞工廠(chǎng)乃至生命系統具有重要價(jià)值。
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