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病毒宏基因組學(xué)方法優(yōu)缺點(diǎn)及意義
隨著(zhù)時(shí)代的發(fā)展和生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新興的病毒宏基因組學(xué)為解決這些問(wèn)題提供了契機，以下是一篇關(guān)于病毒宏基因組學(xué)探究的論文范文，供大家閱讀參考。
病毒個(gè)體微小，多數病毒直徑在100nm(20~200nm)，較大的病毒直徑300~450nm,較小僅為18~22nm,結構簡(jiǎn)單，不能獨立復制需要依賴(lài)于宿主細胞復制繁殖，被許多生物學(xué)家認為是處于生命和非生命交叉區域的存在物。據估計目前對病毒的發(fā)掘還不到1%[1],對病毒的研究具有廣闊的前景和現實(shí)意義。病毒獨特的結構和特性給病毒的研究和鑒別帶來(lái)許多困難，主要體現在兩個(gè)方面：第一，病毒沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的宿主細胞系，60%以上的病毒無(wú)法成功的進(jìn)行離體培養[2]或在培養中不能表達致病性;第二，病毒基因本身變異率高，通過(guò)與宿主間的相互作用進(jìn)化，增加核酸多樣性，產(chǎn)生新病毒，導致宿主范圍擴大、跨物種傳播[3].對細菌的研究可以通過(guò)保守的16sRNA的分析來(lái)定位分類(lèi)信息、進(jìn)化關(guān)系和種群多樣性等。對于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像細菌真菌，沒(méi)有固定保守的進(jìn)化標記基因。
所以一些傳統研究方法的應用受到限制，不能完全滿(mǎn)足病毒研究的需要。如電鏡觀(guān)察病毒的靈敏性不高，細胞培養病毒可能觀(guān)察不到細胞病變，血清學(xué)反應中不但難以獲得高價(jià)抗體而且容易出現交叉反應導致錯誤結果，傳統PCR方法對未知序列及高變異的病毒研究難以發(fā)揮作用。加之近年來(lái)病毒流行病的頻繁發(fā)生及其可怕的傳染性，對人類(lèi)及動(dòng)植物的健康產(chǎn)生嚴重威脅，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，給人們造成了巨大的恐慌和經(jīng)濟損失。因此，對病毒基因組的研究、致病源的探索、病毒在生物體和環(huán)境中如何存在及傳播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。
隨著(zhù)時(shí)代的發(fā)展和生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新興的病毒宏基因組學(xué)為解決這些問(wèn)題提供了契機，宏基因組學(xué)(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，對特定環(huán)境中基因組的總和進(jìn)行研究，包括培養的和未培養的微生物。病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics)就是宏基因組學(xué)在病毒領(lǐng)域的應用，即從環(huán)境或生物組織中濃縮病毒粒子的遺傳物質(zhì)進(jìn)行生物學(xué)信息分析的技術(shù)。它的應用需要一些交叉學(xué)科的創(chuàng )新技術(shù)的支持，隨機引物PCR和新一代測序技術(shù)---高通量測序的應用大大提高了研究的效率和獲取信息的豐度，克服大環(huán)境中病毒濃度低、易受干擾的不足，拓展了病毒宏基因組學(xué)的應用范圍和現實(shí)作用，為探索未知病毒提供廣闊的前景和應用空間。在人類(lèi)預防疾病、開(kāi)發(fā)疫苗方面具有重大貢獻。
1、病毒宏基因組學(xué)的研究過(guò)程
對于未知病毒的研究過(guò)程如下：SISPA方法是1991年Gregory和Jung在隨機引物PCR方法的基礎上創(chuàng )造的[6],SISPA-PCR使用含有已知片段的隨機引物進(jìn)行逆轉錄，這個(gè)已知片段在接下來(lái)的PCR反應中將作為引物[7],此方法先后經(jīng)Breitbart[8]和Djikeng[9]等人的改進(jìn)，在SISPA的基礎上建立了RNase、DNase-SISPA聯(lián)用的方法，增加了樣品過(guò)濾和DNA酶RNA酶消化等步驟，去除外源污染，發(fā)現新病毒。高通量測序(High-throughput se-quencing)也稱(chēng)第二代測序技術(shù)或深度測序[10],可以對數百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行同時(shí)測序，一次可同時(shí)輸出大量數據，打破樣品類(lèi)型局限，最大限度的富集病毒核酸信息。
樣品通過(guò)離心、過(guò)濾、核酸酶處理等步驟去除病毒粒子以外的物質(zhì)和背景核酸的干擾[11],純化和富集病毒粒子，降低錯配率，減少數據量，提高下游分析速率。所以此步驟的富集效果對后來(lái)的高通量測序結果的序列數量有決定性影響。將樣品中的病毒粒子富集到106個(gè)·mL-1以上為理想狀態(tài)[12].然后進(jìn)行核酸DNA和RNA的提取。
病毒基因組比真核和原核宿主短，在核酸制備過(guò)程中要盡量去除污染，一個(gè)小的污染可能導致長(cháng)基因優(yōu)先測序[13],掩蓋病毒基因，可能導致宏基因組分類(lèi)組成成分的偏差。選取幾種隨機單引物對提取的核酸進(jìn)行反轉錄，用Klenow酶合成cD-NA的第二條鏈，然后用相應的引物進(jìn)行PCR擴增，增加樣品中低豐度病毒的檢出率。不同的隨機擴增方法對不同的核酸類(lèi)型(線(xiàn)型、環(huán)形、ss/dsRNA/DNA)有不同的效率[14],應用多種擴增方法和引物可以?xún)?yōu)化檢測大環(huán)境中可能的病毒核酸的靈敏度，增加覆蓋率。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳條帶呈現彌散狀，送生物公司進(jìn)行高通量測序。測序結果產(chǎn)生大量數據，數據的篩選處理和分析是整個(gè)過(guò)程的又一關(guān)鍵步驟，如果數據分析不好，整個(gè)實(shí)驗就不能得到理想的效果，那么海量的測序數據也就失去了意義。
病毒宏基因組的分析流程與一般宏基因組數據分析流程相似，包括原始數據的預處理、基因組裝、功能分類(lèi)和基因預測等。但病毒序列存在高變異性。測序序列中也可能存在原病毒的序列，原病毒以溶原態(tài)存在于宿主染色體內，這將會(huì )影響病毒基因組與宿主的分離[15].
對于發(fā)現新病毒可以將單個(gè)序列和contigs在blastn的nr數據庫中比對，如果比對結果無(wú)法判斷出是何種序列，則在blastx的nr數據庫中比對，比對的E值如果大于e-5則被認為是目前無(wú)法確定的生物的基因序列。如果比對的結果小于e-5又與其最近的那一條的相似性較低，則可能是我們需要關(guān)注的目標[3].
2、病毒宏基因組學(xué)方法的優(yōu)勢和局限
2.1優(yōu)勢
傳統方法只能以已知病毒為目標，難以發(fā)現新病毒，而病毒宏基因組學(xué)方法結合新一代測序技術(shù)和隨機PCR1的病毒;研究的病毒直接從環(huán)境中獲取，不需要分離培養;可以對環(huán)境中過(guò)于分散、豐度低的病毒進(jìn)行系統分析和鑒定。
2.2局限
應用病毒宏基因組學(xué)方法進(jìn)行研究，依然存在一些問(wèn)題需要進(jìn)一步探索，如從大量環(huán)境中提取樣本方式，隨機擴增方法和引物的選擇能否做到無(wú)偏差覆蓋所有病毒，海量測序數據的處理，依賴(lài)樣品復雜度的生物信息分析等。
3、病毒宏基因組學(xué)的應用
病毒宏基因組學(xué)以其顯著(zhù)的優(yōu)勢在病毒研究的各個(gè)方面得到廣泛應用，如人類(lèi)、動(dòng)植物健康，水、環(huán)境問(wèn)題、病毒領(lǐng)域的研究等等。改變著(zhù)人們對病毒的認識，給涉及病毒的許多問(wèn)題提供新的解決思路。
3.1臨床應用
2008年[16]病毒宏基因組學(xué)在人體臨床檢查中第一次應用，結合深度測序檢測器官移植相關(guān)的致死疾病的病原體。利用病毒宏基因組學(xué)對人體的唾液、呼吸道、血液、排泄物的檢測分析，可以發(fā)現未知和潛在的致病病毒。
Law等[17]對一些肝病患者的血漿進(jìn)行研究，發(fā)現病毒宏基因組學(xué)方法快速準確，還能將檢測范圍擴大到其它體液。
單同領(lǐng)[18]根據病毒宏基因組學(xué)的方法分析了兒童和豬腸道病毒群落，并且確定了致病原的信息。
Zhang等[19]應用宏基因組學(xué)在人的糞便中發(fā)現了大量的植物病毒。
Willner等[20]應用宏基因組學(xué)分析了健康和呼吸道感染的人的呼吸道分泌物中的DNA病毒群落。
2010年[21]在沒(méi)有先驗信息的條件下，應用病毒宏基因組學(xué)獲得了流感病毒的全部基因。研究者還通過(guò)監測特定區域內已知傳染人、動(dòng)植物病毒的昆蟲(chóng)媒介攜帶的病毒[22],來(lái)檢測相關(guān)病毒的流行和預防，為突發(fā)病原體的鑒定提供方向。蝙蝠作為很多人獸共患病(例如埃博拉病毒、嚴重急性呼吸系統綜合征(SARS)病毒和尼帕病毒)的自然傳播宿主，故蝙蝠體內的病毒多樣性成為學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
2010年，Li等[23]和Donaldson等[24]應用病毒宏基因組學(xué)的方法分別研究了北美蝙蝠糞便中的病毒群落。發(fā)現了大量新的哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲(chóng)病毒和植物病毒，Donaldson還發(fā)現了一株新的冠狀病毒。
2013年，楊凡力等[25]應用病毒宏基因組學(xué)的方法研究吉林、云南、湖南采集的蝙蝠組1小雙節RNA病毒、圓環(huán)病毒等新病毒。
2000年用病毒宏基因組學(xué)方法對埃博拉病毒進(jìn)行了鑒定[26].
3.2環(huán)境問(wèn)題
病毒能夠抵抗很多常規水處理系統在水中頑固存留，利用病毒宏基因組學(xué)快速檢測水環(huán)境中的病原體，得到的宏基因組數據可以作為排泄物污染的指標，以此檢測水質(zhì)量。
Rosario等[27]應用宏基因組學(xué)在廢水處理廠(chǎng)的污水中發(fā)現了大量的來(lái)自動(dòng)植物和人的致病性病毒，從而認為污水可能是病毒傳播的一種途徑。
3.3病毒研究
目前科學(xué)家正在發(fā)展功能病毒宏基因組學(xué)，來(lái)發(fā)掘新病毒的功能酶[28],用于診斷和生物科學(xué)研究。利用病毒宏基因組學(xué)可以開(kāi)發(fā)不同環(huán)境中的各種病毒如海洋、溫泉、巖石層、地下和高溫環(huán)境等，為研究病毒學(xué)的分類(lèi)和進(jìn)化提供方法。
通過(guò)對環(huán)境病毒宏基因組學(xué)的研究，可以了解環(huán)境中病毒的有機構成、進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而掌握病毒的分布、變化動(dòng)態(tài)和進(jìn)化情況，追蹤一些病原體的原始自然宿主，以便及時(shí)防控和預測一些常發(fā)和新發(fā)病毒病，還可以通過(guò)改變病變環(huán)境中的微生物群落來(lái)對抗病理性群落，從而達到改善病情甚至是治療的效果[29].
4、病毒宏基因組學(xué)的研究意義
病毒宏基因組學(xué)的應用為病毒生態(tài)學(xué)在研究遺傳潛力、病毒群落組成和結構以及環(huán)境病地理學(xué)等問(wèn)題提供廣闊的前景和方向。病毒宏基因組學(xué)還涉及了病毒和宿主之間的相互作用，病毒一些裸露在外的基因可能以某種未知的方式操控宿主，這對一些疾病的致病機理的分析、制定有效的治療方法具有重大意義。病毒宏基因組學(xué)發(fā)現病毒的潛力能夠推動(dòng)許多相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，如進(jìn)化生物學(xué)、病原體的檢測和生物技術(shù)。
病毒宏基因組學(xué)對一定環(huán)境內的全部病毒的研究起到了里程碑式的作用，此環(huán)境可以是海洋、土壤等無(wú)機環(huán)境，也可以是各種生物體的組織等有機環(huán)境。在病毒研究領(lǐng)域具有劃時(shí)代意義。
5、展望
隨著(zhù)生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些交叉學(xué)科創(chuàng )新技術(shù)的發(fā)現，能夠更加完善病毒宏基因組學(xué)的研究體系，例如搭建更為豐富的微生物基因組數據庫，開(kāi)發(fā)病毒宏基因組學(xué)檢測領(lǐng)域的分析工具，將宏基因組學(xué)與宏轉錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)等技術(shù)結合起來(lái)在組學(xué)研究的多個(gè)層面上探索微生物的多樣性等，使此項技術(shù)能夠更廣泛更準確的應用于病毒相關(guān)領(lǐng)域。通過(guò)對人體內微生物種群多樣性的研究來(lái)探索其與某些疾病、耐藥情況[30]的可能關(guān)系。此技術(shù)還可以用來(lái)發(fā)現新的酶物質(zhì)、抗生素以及一些有用的次生代謝產(chǎn)物。地球上海洋面積約占總面積的72%,富含豐富的資源，利用宏基因組學(xué)對海洋微生物的開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。
期待未來(lái)的某一天能夠利用此技術(shù)攻克如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和埃博拉病毒等高傳染性、高致死率、嚴重威脅全人類(lèi)生命健康的病毒病。
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