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淺談化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究進(jìn)展論文
建立在放射免疫分析技術(shù)理論基礎上的化學(xué)發(fā)光免疫分析，是一種非放射標記免疫分析法，這種免疫分析方法主要以標記發(fā)光劑為示蹤物信號建立起來(lái)。近十年來(lái)在世界范圍內發(fā)展迅速，它具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡(jiǎn)便快速、標記物穩定性好、無(wú)污染、儀器簡(jiǎn)單經(jīng)濟等優(yōu)點(diǎn)。
1 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的研究歷史背景
免疫分析的發(fā)展伴隨著(zhù)抗體制備技術(shù)的改進(jìn)而不斷提高。美國科學(xué)家Yalow等人首先將標記技術(shù)引入免疫分析，他們首先用放射免疫分析法(RIA)進(jìn)行測定胰島素。由于這種試驗方法限制了試劑的壽命，難以獲得長(cháng)期穩定的檢測標準，同時(shí)由于存在同位素的使用，不僅會(huì )損害操作人員身體健康，也會(huì )帶來(lái)污物處理困難的問(wèn)題。為了找到更為合理的免疫分析法成為以后20年來(lái)研究的熱點(diǎn)。直到70年代末，國外有學(xué)者將免疫反應與化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)相結合，這種集高靈敏度和高特異性的技術(shù)稱(chēng)之為化學(xué)發(fā)光免疫分析法，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)優(yōu)勢比較明顯，主要有以下幾點(diǎn)：第一，靈敏度高，檢測限范圍更精準;第二，自動(dòng)化程度高，并且沒(méi)有放射性輻射危害;第三，發(fā)光標記物穩定，有效期長(cháng)，同時(shí)應用范圍寬，對于分子大小不同的抗原、半抗原及抗體都可檢測。因此，化學(xué)發(fā)光免疫分析在臨床、衛生、食品、環(huán)保和軍事等領(lǐng)域正被越來(lái)越多地用于激素、蛋白質(zhì)、腫瘤、毒物、病毒等成分檢測。
2 免疫分析基本原理
由免疫反應系統和化學(xué)發(fā)光分析系統兩個(gè)關(guān)鍵部分組成了化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理，化學(xué)發(fā)光分析系統主要氧化以及催化的作用于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體，在處于穩定狀態(tài)時(shí)，發(fā)射出光子，然后通過(guò)測量?jì)x器測量光量子。通過(guò)標記物與發(fā)光強度的關(guān)系，進(jìn)而測出被測物質(zhì)含量。而免疫反應系統是將發(fā)光物質(zhì)在抗原或抗體上直接標記。
3 化學(xué)免疫分析分類(lèi)
化學(xué)發(fā)光免疫分析法主要以標記法的不同來(lái)進(jìn)行分類(lèi)，目前習慣上將免疫分析法主要分為兩類(lèi)，第一主要是標記免疫分析法，其次是酶免疫分析法，前者是以化學(xué)發(fā)光標記，后者是以酶標記，以化學(xué)發(fā)光底物作為信號試劑來(lái)進(jìn)行發(fā)光，其原理是不相同的。除此之外，包括熒光免疫分析法以及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法也是目前存在的化學(xué)免疫法分析方法。
3.1 化學(xué)發(fā)光標記免疫分析
將化學(xué)發(fā)光劑如吖啶酯類(lèi)化合物，直接標記在抗原上或抗體上，其基本原理是啟動(dòng)發(fā)光劑發(fā)光，快速閃爍。這種標記物其化學(xué)反應簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑;夾心法用于大分子抗原，競爭法主要用于檢測小分子抗原，另外本底低，非特異性結合相對較少光量不會(huì )因為分子大小而受影響，因此能增加靈敏度，一般常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)主要是通過(guò)啟動(dòng)發(fā)光試劑NaOH-H2O2作用而發(fā)光，其發(fā)光非常迅速，小分子物質(zhì)多采用競爭法，夾心法主要用于大分子物質(zhì)。
3.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
通過(guò)酶標記生物活性物質(zhì)，再作用于發(fā)光底物，在信號劑的作用下發(fā)光，然后用發(fā)光測定儀進(jìn)行測定�；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析酶反應的底物是發(fā)光劑，按照標記免疫分析，應屬酶免疫分析，其操作步驟與酶免分析完全相同。目前常用的標記酶為堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶，它們有各自的發(fā)光底物�；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析法種類(lèi)大致有三種，首先是HRP標記CLEIA，一般常用3-氨基鄰苯二甲酰肼作為底物，也即是魯米諾或者用其衍生物4-氨基鄰苯二甲酰肼也是可以的，這兩種都是重要的發(fā)光試劑。需要注意的是該底物需要在堿性緩沖溶液中進(jìn)行氧化反應，生成激發(fā)態(tài)中間體，當然這需要在過(guò)氧化物酶及活性氧存在的條件下進(jìn)行，中間體回到基態(tài)時(shí)就可以發(fā)光，此時(shí)的波長(cháng)一般在425nm。曾經(jīng)先前有人用該標記底物標記抗原或抗體，但后來(lái)發(fā)現其發(fā)光強度多受靈敏度的影響。目前用過(guò)氧化物酶進(jìn)行標記，其發(fā)光強度主要依賴(lài)酶免疫反應中的酶的濃度大小;其次增強發(fā)光酶免疫分析也是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的一種，它主要是在將增強的發(fā)光劑加入到發(fā)光系統中，加強發(fā)光的信號強度，并且能夠保持長(cháng)時(shí)間的穩定性，在一定程度上提高了該分析方法的準確性和靈敏度，便于多次測定。目前在一些現代化的設備上，還可以由計算機進(jìn)行精確控制操作，比如，往系統中加入發(fā)光試劑以及混合、溫育、洗滌等，甚至后期的數據處理，進(jìn)而繪制標準曲線(xiàn)，最終完成患者血清樣品的分析并打印出結果;最后一種就是用ALP標記的CLEIA，這種分析方法一般多用環(huán)-1，22-二氧乙烷衍生物作為發(fā)光底物，它的發(fā)光原理主要是其用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析底物而設計的分子結構穩固，其中的芳香基作為發(fā)光基團和酶作用，在發(fā)光試劑的作用下發(fā)光，該底物在堿性磷酸酶的作用下，磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基，就會(huì )產(chǎn)生一個(gè)穩定的中間體，然后中間體發(fā)生裂解會(huì )產(chǎn)生金剛烷酮和激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，這種常見(jiàn)底物是AMPPD，其作為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物，多用來(lái)檢測堿性磷酸酯酶和一些配基的結合物。
4 應用
4.1 激素、蛋白質(zhì)和腫瘤檢測
該系統使反應物形成均相混懸液，順磁微粒作為固定相，增大反應面積，加速免疫反應，快速分離，自動(dòng)洗滌，減少酶和催化劑的使用，pH調整即可，避免了許多影響因素，廣泛應用于甲狀腺功能、藥物檢測、腫瘤標志物及心血管等項目。
4.2 病毒、毒物檢測
楊秀岑等用ABEI標記兔抗大腸桿菌lgG，試樣溫育、離心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 發(fā)光體系測定;章竹君等測定了糞樣中的輪狀病毒以HRP酶標記;為研究TNT對人體的毒害作用提供方法，張麗民等以HRP標記免疫測定了血清中4-氨基-2，6-二硝基甲苯，效果非常顯著(zhù)。
4.3 其他方面的應用
被越來(lái)越多地用于免疫測定中的HRP酶標記生成核酸探針，主要采用兩種形式，一種是靶DNA雜交，將HRP直接標記在探針上，同時(shí)增強的魯米諾試劑檢測加入分離后的雜交體。另外一種是將DNA探針標記在生物素及地高辛上，然后與靶DNA雜交，再用HRP標記的親和素和抗地高辛與分離后的雜交體結合，最后加入魯米諾試劑氧化發(fā)光。
5 展望
化學(xué)發(fā)光免疫分析已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的一種重要的檢測方法，其相比較于傳統的放射免疫分析方法，其安全、穩定、測量快速等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應用。當然，目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)也存在不少的問(wèn)題，例如，化學(xué)發(fā)光標記物質(zhì)量和穩定性差，包括標記技術(shù)都是比較落后的。因此，要想獲得更為廣泛的發(fā)展和使用空間，首先要加快國產(chǎn)發(fā)光免疫分析試劑盒的研發(fā)，另外要提高分析和測定的穩定性，只有這樣，將來(lái)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)用于臨床醫學(xué)檢驗，才能帶來(lái)更大的獲益。
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